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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-200608

Resumo

Os objetivos deste estudo foram (i) mapear e identificar as proteínas do plasma seminal de coelhos da raça Nova Zelândia Branca, utilizando as técnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa e estimar associações entre essas proteínas com os parâmetros espermáticos e (ii) caracterizar a expressão do fator de crescimento nervoso, poliptido beta ( -NGF), e os seus receptores cognatos neurotróficos da tirosina-quinase de tipo 1 (NTRK1) e receptor fator de crescimento nervoso (NGFR) nas gônadas e glândulas sexuais de coelhos da raça Nova Zelândia Branca, bem como as concentrações de NGF no plasma seminal de animais sexualmente maduros, utilizando as técnicas de RT - PCR e imunohistoquímica. Também foi dosada a concentração da NGF no sangue e no plasma seminal através da técnica de ELISA. O estudo 1 foi realizado na Universidade Federal do Ceará, na cidade de Fortaleza-Ce. Foram coletados amostras de sêmen de 18 coelhos adultos, utilizando- se uma vagina artificial. Após a coleta procedeu-se a avaliação dos parâmetros qualidade seminal: motilidade, vigor, concentração espermática, morfologia espermática e os testes funcionais: integridade de membrana, integridade acrossomal e vitalidade. O plasma seminal foi obtido pela centrifugação do sêmen, e submetido à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest. Os spots foram cortados individualmente dos géis, digeridos com tripsina, e submetidos à identificação por espectrometria de massa (ESI- QUAD-TOF). Os resultados obtidos foram submetidos a avaliação estatística para verificar a existência de associações entre entre a presença e/ou intensidade dos spots presentes nos mapas protéicos do plasma seminal com os parâmetros de qualidade seminal. As associações entre os parâmetros dos espermatozoides ejaculados e a expressão das proteínas do plasma seminal dos coelhos foram estimadas por modelos de regressão múltipla usando o procedimento REG do aplicativo estatístico SAS (v.9.0, 2002) com a seleção STEPWISE. Foram detectados 232 ± 69,5 spots protéicos por gel, com 34 spots presentes consistentemente em todos os géis. Esses 34 spots corresponderam a 15 % do total do número de spots, representando 32 % da intensidade óptica de todos os spots. A espectometria de massa identicou aproximadamente 95% dos spots detectados (220 spots de um total de 232), que corresponderam a 87 proteínas diferentes. As proteínas mais abundantes foram as anexinas, zeta-globina, lipocalinas, proteina FAM 115 e um grupamento de serpinas. Outras proteínas também foram identificadas, tais como: transferrina, heat shock protein, glutationa transferase, entre outras. Também foi identificada apresença da proteína fator de crescimento nervoso (NGF) que tem sido relatada em outras espécies como fator de indução à ovulação. As 87 proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos participam principalmente dos processos biológicos associados a processos celulares (65,25 %), regulação (64,25 %) e resposta a estímulos (22,9 %). Foram observadas associações significativas entre as proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos com os parâmetros espermáticos avaliados,tais como vigor, número de células viáveis, morfologia espermática e células com membranas funcionais foram associados com proteínas específicas. Foram observadas associações de várias proteínas com um mesmo parâmetro espermático. De acordo com a literatura, este representa o primeiro relato sobre o proteoma do plasma seminal de coelhos e seu papel sobre os parâmetros seminais. O conhecimento dessas proteínas contribuirá para uma melhor compreensão dos mecanismos de regulação do plasma seminal sobre a função espermática em coelhos. O estudo 2 foi conduzido na Università Degli Studi di Perugia, na cidade de Perugia-Pe, Itália. Foi avaliada a expressão da proteína NGF que foi previamente identificada no estudo 1. A imunorreatividade e a expressão gênica da NGF e os seus receptores cognatos foram detectados nos testículos, próstata e vesícula seminal. Os níveis mais elevados de NGF e NTRK1 transcritos foram encontrados na próstata, enquanto expressões intermediárias foram encontradas no testículo. NGFR transcritos foram expressos nos mesmos níveis em ambos os testículos e da próstata e eram mais abundantes do que nas vesículas seminais. A distribuição generalizada de NGF em todas as células glandulares da próstata, juntamente com a sua abundância de RNAm relativo, confirmam que a próstata é das principais fontes desta neurotrofina em coelhos. Em conclusão, os presentes dados sugerem que o sistema NGF está envolvido no desenvolvimento testicular e espermatogênese de coelhos e que o NGF pode atuar como um potencial fator de indução à ovulação, sendo abundantemente presentes no plasma seminal.

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The aim this study were (i) to map and identify proteins in seminal plasma of New Zealand white rabbits strain, using the techniques of two-dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry and to estimate associations between these proteins with sperm parameters and (ii) characterize expression of the nerve growth factor polypeptide beta ( -NGF) and its cognate neurotrophic receptor tyrosine kinase type 1 (NTRK1), and nerve growth factor receptor (NGFR) at gonads and sex glands in adult New Zealand white rabbits as well as the NGF concentration in seminal plasma of sexually mature animals, using RT - PCR and immunohistochemistry. Also was measured the NGF concentration in the blood and seminal plasma by ELISA. Study 1 was performed at Federal University of Ceará, in Fortaleza-Ce. Semen samples were collected from 18 adult rabbits, using an artificial vagina. After collecting proceeded to the evaluation of semen quality parameters: total motility, individual progressive motility, sperm concentration, sperm morphology and functional tests: membrane integrity (HOST), acrosomal integrity and vitality. The seminal plasma was obtained by centrifugation of semen, and subjected to two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed in PDQuest application. The individual spots were excised from the gels, digested with trypsin, and submitted to mass spectrometry (ESI-QUAD-TOF) to identification. The results were subjected to statistical analysis to verify the existence of associations between the presence and / or intensity of the spots present in the protein maps of seminal plasma with the semen quality parameters. The associations between the parameters of ejaculated sperm and the expression of seminal plasma proteins of rabbits were estimated by multiple regression models using the REG procedure of SAS statistical application (v.9.0, 2002) with STEPWISE selection. 232 ± 69.5 spots/gel were detected with 34 spots consistently present in all gels. These 34 spots corresponded to 15% of the total number of spots, representing 32% of the optical intensity of all the spots. Mass spectrometry identified approximately 95% of the detected spots (identified: 220 spots; analyzed: 232 spots), which corresponded to 87 different proteins. The most abundant proteins were the annexins, zeta-globin, lipocalin, FAM 115 protein and a serpins cluster. Other proteins also have been identified, such as transferrin, heat shock protein, glutathione transferase and others. The NGF (protein nerve growth factor) presence also has been identified which has been reported in other species such as ovulation induction factor. This 87 proteins identified in seminal plasma of rabbits participate mainly of biological processes associated with cellular processes (65.25%), regulation (64.25%) and response to stimuli (22.9%). Significant associations were observed between the proteins identified in seminal plasma of rabbits with sperm evaluated parameters such as individual progressive motility, sperm viability, cells with morphology and functional membranes have been associated with specific proteins. Associations were observed for several proteins with the same sperm parameter. According to literature, this is first report about the proteome of seminal plasma of rabbits and its role on the seminal parameters. Knowledge of these proteins contributes to a better understanding of the regulatory mechanisms of seminal plasma on sperm function in rabbits. Study 2 was conducted at Università Degli Studi di Perugia in the city of Perugia-Pe, Italy. It was evaluated the expression of NGF protein that was previously identified during study 1. The immunoreactivity and gene expression of NGF and cognate receptors were detected in testis, prostate and seminal vesicle. The highest levels of NGF and NTRK1 transcripts were found in prostate, while intermediate expressions were found in testis. NGFR transcripts were expressed at the same level on both the testis and prostate, and were more abundant than in seminal vesicles. The widespread distribution of NGF in all glandular cells of the prostate, coupled with its high abundance of mRNA on confirm that the prostate is a major source of this neurotrophin in rabbits. In conclusion, the present data suggest that NGF is involved in developmental system and spermatogenesis of testis rabbits and that NGF can act as a potential factor for induction of ovulation, being abundantly present in seminal plasma.

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