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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-201746

Resumo

O gene floR descrito é relacionado na literatura como responsável pela resistência ao florfenicol, que é um antimicrobiano amplamente utilizado na aquicultura. Esse gene já foi relatado em muitas espécies de bactérias, inclusive no gênero Aeromonas. Essas bactérias causam alta mortalidade na piscicultura trazendo prejuízos econômicos. É importante que haja estudos sobre esse gene e possíveis mutações que possam levar a alterações na estrutura e função da proteína. O objetivo desse estudo foi caracterizar o gene floR em isolados de Aeromonas spp. e verificar se a presença desse gene está associada com a resistência ao florfenicol em Aeromonas spp. obtidas do Vale do são Francisco. Foram realizadas reações em cadeia da polimerase (PCR) do gene rRNA 16S para identificação de genêro dos isolados. PCRs também foram realizadas para verificar a presença do gene floR. Amostras positivas para a presença do gene foram sequenciadas e analisadas quanto a presença de polimorfismos por meio de alinhamentos. Os diferentes haplótipos detectados foram utilizados para análises com os programas SIFT e PolyPhen para predição de alteração de função proteica. A modelagem estrutural da proteina codificada pelo gene floR foi realizada com o programa Modeller e, os modelos foram avaliados pelo Procheck, Verify3D e Whatif. A similaridade das estruturas tridimensionais da proteína referência foi comparada com as estruturas tridimensionais das proteínas codificadas pelos diferentes haplótipos através do TM-align. A resistência das bactérias ao florfenicol foi avaliada através do teste de microdiluição em caldo, o qual também foi realizado na presença do carbonil cianeto m-clorofenil hidrazona para verificar o efeito da inibição da bomba de efluxo sobre tal resistência. Dentre os 45 isolados avaliados, 27 foram confirmados como pertencentes ao gênero Aeromonas e foram verificadas quanto a presença do gene floR. Dez isolados positivos para o gene foram sequenciados, o que permitiu identificação de 3 polimorfismos no gene floR, que levaram a construção de 3 haplótipos diferentes (TAA, TTA e CTG). As análises realizadas com os programas SIFT e PolyPhen apontaram que os haplótipos TTA e TAA provavelmente poderiam alterar a estrutura-função da proteína. As proteínas modeladas para os três haplótipos demonstraram possuir praticamente a mesma conformação estrutural entre si. Todos os isolados que apresentaram o gene foram resistentes ao florfenicol e aqueles que não apresentavam foram sensíveis. O teste na presença do Carbonil Cianeto m-Clorofenil Hidrazona foi realizado para 3 isolados, cada isolado representando um haplótipo, sendo possível observar a inibição do crescimento bacteriano em todas as concentrações independente do haplótipo. Os resultados obtidos nesse estudo mostram que a resistência ao flofenicol em Aeromonas spp. pode ser explicada pela presença do gene floR, e que esse gene está relacionado com uma bomba de efluxo. As mutações verificadas no gene floR, parecem não estar envolvidas com alteração de estrutura e função da proteína codificada por esse gene.

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The floR gene is described in related literature as responsible for resistance to florfenicol, which is a widely used antimicrobial agent in aquaculture. This gene has been reported in many species of bacteria, including the genus Aeromonas. These bacteria cause high mortality in fish farming bringing economic losses. It is important that studies of this gene and possible mutations that can lead to changes in the structure and function of the protein. The aim of this study was to characterize the flower gene in isolates of Aeromonas spp. and check the presence of this gene is associated with resistance to florfenicol in Aeromonas spp. obtained from the San Francisco Valley.The polymerase chain reaction were performed (PCR) for the 16S rRNA gene for genus identification of isolates. PCRs were also performed to verify the presence of the floR gene. Positive samples for the presence of the gene were sequenced and analyzed for the presence of polymorphisms using alignments. Different haplotypes detected were used for analysis with the SIFT and PolyPhen programs for prediction of changes in protein function. The structural modeling of protein encoded by the floR gene was performed using the program Modeller, and the models were evaluated by Procheck, Verify3D and Whatif. The similarity of the three-dimensional structures of the reference protein were compared with the three-dimensional structures of the proteins encoded by the different haplotypes by TM-align. Bacterial resistance to florfenicol was assessed by the microdilution test, which was also performed in the presence of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone to verify the effect of inhibiting the efflux pump of such resistance. Among the 45 isolates evaluated, 27 were confirmed as belonging to the genus Aeromonas, and were checked for the presence of the floR gene. Ten isolates were positive for the gene sequenced, which allowed the identification of polymorphisms in 3 floR gene, which led to the construction of three different haplotypes (TAA TTA and CTG). The analyzes carried out with the SIFT and PolyPhen programs showed that the TTA and TAA haplotypes could probably change the protein structure-function. Proteins modeled for the three haplotypes were found to have substantially the same structural conformation with each other. All isolates presenting the gene were resistant to florfenicol and those who did not have were sensitive. The test in the presence of carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone was conducted for 3 isolates, representing each single haplotype and was observed inhibition of bacterial growth at all concentrations independent of the haplotype. The results of this study show that resistance in flofenicol Aeromonas spp. May be explained by the presence of floR gene and that this gene is associated with an efflux pump. Mutations observed in floR gene do not appear to be involved with altered structure and function of the protein encoded by that gene.

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