Investigação da microbiota gastroentérica e desenvolvimento de IgY para fins diagnósticos em ema (Rhea americana)

RESUMO

IgG anti-IgY de ema (Rhea americana) foi produzida em caprino e coelho para uso como imunoferramenta diagnóstica para a espécie. A IgY de ema se mostrou mais imunogênica para o caprino que para os coelhos. Foi observado por ELISA alta especificidade desses anticorpos para a espécie estudada, sendo o antiema produzido em coelhos mais específica para fins diagnósticos na espécie. IgY de gema de ovos de ema foi isolada por precipitação por sulfato de amônia a 29% e purificação em coluna de afinidade, pelo que foi possível observar as cadeias leves e pesada da imunoglublina com aproximadamente 30 kDa e 70 kDa, respectivamente. Proteína recombinante anti-flagelina de fase dois de Salmonella enterica sv. Enteritidis PT4 (recFljB) foi eficientemente obtida utilizando as construções plasmídeal pGEX-fljB em Escherichia coli DH5 e BL21(DE3) e utilizada para imunizar emas e galinhas. A IgY específica anti-recFljB foi obtida da gema de ovos dessas aves com alto rendimento (4,82 mg/mL para galinhas e 11,68 mg/mL para emas). IgY anti-recFljB obtidas de ovos de emas e galinhas diminuiu a capacidade de aderência e invasão das cepas S. Enteritidis PT4 e Salmonella entérica sv.Typhimurium em células CACO-2 e HT-29, respectivamente. IgY anti-recFljB de emas e galinhas também foi capaz de inibir o crescimento dessas bactéria em meio líquido (BHI 0,3M de NaCl). Foram isolados 203 microrganismos de 63 emas de cativeiro clinicamente saudáveis provenientes de três criatórios diferentes entre 2012 e 2014. Sendo 132 bactérias Gram-negativas, potencialmente patogênicas e resistentes fenotipicamente a antibióticos da microbiota oral e cloacal das emas (E. coli, Escherichia fergusonii, Edwardsiella spp., Yersínia spp., Enterobacter spp., Francisella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella avium, Pseudomonas spp.e Acinetobacter spp.). Por PCR identificou-se 11,6% de cepas de E. coli entropatogênicas (EPEC). Genes de resistência a antibióticos -lactâmicos foram identificados em E. coli (22,1% blaCTX-M, 26,7% de blaSHV e 14% blaTEM) e em Klebsiella spp. (100% de blaSHV e 14,3% blaTEM). Foram isoladas 71 bactérias Gram-positivas, potencialmente patogênicas, e com resistência a antimicrobianos, da microbiota oral e cloacal das emas Staphylococcus spp. coagulase negativa (SCN), Enterococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., e Micrococcus spp. Por PCR identificou-se a presença do gene mecA em 44.4% dos SCN e das enterotoxinas SEA (66,7%) e SEB(8,3%) nas cepas SCN. A identificação da microbiota das emas pode auxiliar na prevenção de diferentes patologias, assim como fornecer dados para estudos da epidemiologia das bactérias. Os resultados deste estudo também podem ser utilizados para a criação de novas estratégias de profilaxia de doenças, como por exemplo, a utilização e imunoglobulinas aviárias específicas. Ainda foi discutido o fato das emas abrigarem bactérias resistentes a antibióticos e produtoras de enterotoxinas e, por isso, serem veículo de disseminação dessas linhagens de microrganismos. Nesse sentido, o presente estudo pode contribuir para o fornecimento de novas informações sobre a associação de microrganismos potencialmente patogênicos em Rhea americana, além de demonstrar a necessidade da realização de novas pesquisas focadas nas diferentes temáticas levantadas e no monitoramento de microrganismos em aves silvestres e de cativeiro.

ABSTRACT

IgG anti-IgY from greater rhea (Rhea americana) was produced in goat and rabbit, for use as a immunodiagnostic tool for the specie, and greater rhea's IgY was more immunogenic for the goat than for rabbits. ELISA assays show high specificity of these antibodies for this species, and the anti-greater rhea produced in rabbits were more specific for diagnostic purposes in the species. IgY greater rhea egg yolk was isolated by precipitation by ammonium sulfate at 29% and purification was performed by affinity column where it was possible to observe light and heavy chains of immunoglobulin approximately 30 kDa and 70 kDa, respectively. Recombinant Protein anti-flagellin of phase two of Salmonella enterica sv.Enteritidis PT4 (recFljB) was efficiently obtained using the constructions plasmideal pGEX-fljB in E. coli DH5 and BL21 (DE3) and used to immunize rheas and hens and a IgY specific anti-recFljB was obtained from egg yolk of these birds with high yield (4.82 mg/mL for hens and 11.68 mg/mL for rheas). IgYanti-recFljB obtained from eggs of rheas and hens decreased the adhesion and invasion of the strains S. enteritidis PT4 and Salmonella enterica sv.Typhimurium in CACO-2 and HT-29 cells, respectively. IgYanti-recFljB from rheas and hens was also able to inhibit the growth of these bacteria in liquid medium (BHI 0.3M NaCl). 203 microorganisms were isolated from 63 clinically healthy rheas kept in captivity from three different CEMAS, between 2012 and 2014. 132 bacteria were Gram-negative, potentially pathogenic and phenotypically resistant to antibiotics, from oral and cloacal microbiota of rheas (E. coli, Escherichia fergusonii, Edwardsiella spp., Yersinia spp. , Enterobacter spp., Francisella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella avium, Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp.). 11.6% of strains of enteropathogenic. E. coli (EPEC) was identified by PCR. Beta lactam antibiotic resistance genes were identified in E. coli (22.1% blaCTX-M, 26.7% of blaSHV and 14% blaTEM) and Klebsiella spp. (100% of blaSHV and 14.3% blaTEM). 71 Gram-positive bacteria were isolated from the oral and cloacal microbiota of rheas, all of them potentially pathogenic and with resistance to antimicrobials coagulase negative Staphylococcus (CNS), Enterococcus spp. , Streptococcus spp. , Corynebacterium spp. , and Micrococcus spp. The presence of the mecA gene was confirmed by PCR in 44.4 % of CNS and enterotoxins SEA (66.7 %) and SEB (8.3 %) were confirmed in CNS strains. The identification of the microbiota of rheas can help in the prevention of various diseases, as well as provide data for epidemiological studies of bacteria. The results of this study may also be used for the creation of new strategies for prophylaxis diseases, such as the use and avian specific immunoglobulins. The fact that greater rheas may shelter antibiotic-resistant and enterotoxin producing bacteria has also been discussed and therefore they would act as a dissemination vehicle of these strains of microorganisms. In this sense, the present study may contribute to the provision of new information on the association of potentially pathogenic microorganisms in Rhea americana, as well as to demonstrate the need for further research focused on different themes raised and monitoring microrganisms in wild birds and in captivity.