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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-202111

Resumo

A elaboração de meios adequados e específicos para o processo de capacitação espermática, bem como, para o cultivo dos gametas e embriões pode alavancar a eficiência das biotécnicas da reprodução na espécie bubalina. A L-arginina (LA) e a metil -ciclodextrina (MBCD) tem mostrado resultados promissores ao melhorar a motilidade e induzir a capacitação espermática em varias espécies, no entanto seus efeitos sobre o desenvolvimento do embrionário são poucos conhecidos. Assim, nossa hipótese é que o uso dessas substâncias como agentes indutores de capacitação como podem melhorar a taxa de fecundação e formação de embriões bubalinos. Para isso, foram avaliados o uso da LA e da MBCD(0,5mM, 0,75mM e 1,5 mM) e heparina como agentes no processo de capacitação espermática e na produção in vitro de embriões bubalinos, através das taxas de exocitose acrossomal, viabilidade espermática, potencial de membrana mitocondrial e fosforilação resíduos de tirosina nos diferentes períodos de incubação (0, 3 e 6 horas) de pré-capacitação. Foram utilizados os fluorocromos, como o isotiocianato de fluoresceína conjugado lectina Pisum sativum (PSA-FITC), o iodeto de 5,5', 6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1) e o iodeto de propídio (PI) através da citometria de fluxo. Para analise do estado de fosforilação de resíduos de tirosina o anticorpo anti-fosfotirosina monoclonal conjugado com Alexa Fluor 488 em microscopia de epifluorescência. Além disso, foi determinado também o efeito dos agentes capacitantes na produção in vitro de embriões bubalinos. Nos períodos de 3 e 6 horas de incubação a taxa de lesão de membrana plasmática e acrossomal foi maior na concentração 1,5mM de MCBD quando comparado aos demais grupos (0,5mM, 0,75mM) heparina, L-arginina e controle (p<0.05). Quanto ao potencial de membrana mitocondrial as taxas foram semelhantes entre os grupos, porém houve diminuição do potencial a partir de 3 horas. Quanto a fosforilação dos resíduos de tirosina houve aumento gradativo a partir de 3 horas, mas não houve diferença entre grupos e entre os períodos de 3 e 6 horas (p>0.05). Já em relação, a produção in vitro de embriões bubalinos à taxas de clivagem e blastocistos foram semelhantes nos grupos heparina e CBDM. Porém, não foi observada formação de embriões nos grupos controle negativo e LA. O uso de MBCD na diferentes concentrações apresentaram resultados semelhantes ao controle positivo, demonstrando que MBCD pode ser utilizada como um substituto da heparina.

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The development of appropriate and specific means for the sperm capacitation process, as well as for the cultivation of gametes and embryos can leverage the efficiency of reproductive biotechnologies in buffalo species. L-arginine (LA) and methyl -cyclodextrin (MBCD) has shown promising results in improving the motility and induce sperm capacitation in various species, however its effects on the developing embryo few are known. Thus, our hypothesis is that the use of these substances as training inducing agents how they can improve the fertilization rate and formation of buffalo embryos. For this, we evaluated the use of LA and MBCD (0.5 mM, 0.75 mm and 1.5 mM) and heparin as agents in the sperm capacitation process and the in vitro production of buffalo embryos through rates of acrosome exocytosis , sperm viability, mitochondrial membrane potential and phosphorylation of tyrosine residues on different incubation times (0, 3 and 6 hours) pre-training. fluorochromes were used as fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum lectin (FITC-PSA) iodide 5,5 ', 6,6'-tetrachloro-1,1', 3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1 ) and propidium iodide (PI) by flow cytometry. To analyze the state of phosphorylation of tyrosine residues monoclonal anti-phosphotyrosine antibody conjugated with Alexa Fluor 488 in epifluorescence microscopy. Furthermore, it was also determined the effect of enabling agents in vitro production of embryos buffaloes. In periods of 3 and 6 hours of incubation of the plasma membrane injury rate and acrosome was higher in concentration of 1.5 mM MCBD when compared to other groups (0.5 mM, 0.75 mm) heparin, L-arginine and control (p <0.05). As for the mitochondrial membrane potential rates were similar between groups, but there was a decrease in potential from 3 hours. The phosphorylation of tyrosine residues was increased gradually from 3 hours, but there was no difference between groups and between periods of 3:06 hours (p> 0.05). In comparison, the in vitro production buffalo embryo cleavage rate and blastocyst were similar in heparin and CBDM groups. However, there was no formation of embryos in the negative control groups and LA. The use of MBCD in different concentrations showed similar results to the positive control, demonstrating that MBCD can be used as a substitute for heparin.

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