Produção in vitro de embriões ovinos na presença de cafeína e vitamina E

RESUMO

Objetivou-se avaliar o efeito do uso da vitamina E e da cafeína nas diferentes etapas da produção in vitro de embriões ovinos no Semiárido do Nordeste do Brasil. Foram utilizados ovários de ovelhas sem padrão racial definido, obtidos do abatedouro local do município de Petrolina-PE, que foram transportados em solução de NaCl 0,9% acrescida de antibiótico (penicilina), à de 33ºC a 35ºC até o Laboratório de Fisiologia e Biotecnologia da Reprodução Animal LAFIBRA, UNIVASF. Os oócitos foram obtidos pela técnica de aspiração folicular com bomba de vácuo e rastreados e classificados sob estereomicroscópio. Os oócitos de melhor qualidade seguiram para a maturação in vitro (MIV), onde foram divididos, aleatoriamente, em 4 grupos Grupos VE0, VE50, VE100 e VE200, que continham 0, 50, 100 ou 200 µM de vitamina E, respectivamente. O meio de base utilizado para a MIV foi o TCM-199, suplementado com 2,2 mg de bicarbonato de sódio, 5 mg de LH, 0,5 mg de FSH e 10% de soro fetal bovino. Os oócitos maduros seguiram para fecundação in vitro (FIV), onde foram divididos em 4 grupos Grupo C0, C5, C10 e C20, que continham 0, 5, 10 ou 20 mM de cafeína, respectivamente. O meio FIV foi composto por SOF-FIV, contendo 40 µg de sulfato de gentamicina, 10% de soro de ovelha em estro (SOE) e 1 mg de heparina sendo a concentração de espermatozoides ajustada para 1x106 espermatozoides/mL. Utilizou-se o tempo de co-cultivo de 22 horas, seguido por posterior avaliação dos presumíveis zigotos. Para comparação dos parâmetros, entre os grupos, foi utilizada a Análise de Variância (ANOVA) one-way, seguida da realização do teste de Tukey. Os dados em porcentagem foram submetidos ao Teste de Fisher ou Qui-quadrado, por meio do software estatístico ASSISTAT (2011). As comparações foram consideradas significativas quando P<0,05. Não foi observada diferença estatística (P>0,05). Com relação à taxa de maturação ocitária não foi observada diferença estatística (P>0,05), entre grupos suplementados com diferentes concentrações de vitamina E. Não houve diferença significativa entre os tratamentos para ambos os graus de picnose e retração. Não foi observada diferença significativa entre os grupos (P>0,05), porém, o grupo VE100 apresentou oócitos com coloração heterogênea. Através dessa avaliação, também foi observado que, dentro de cada tratamento, houve o predomínio significativo (P<0,05) de complexos cumulus oócitos homogêneos quando comparados às demais categorias (levemente heterogêneos e heterogêneos). O uso de 5 mM (C5) de cafeína como promotor de capacitação espermática de sêmen ovino para a FIV reduziu (P<0,05) a taxa de fecundação oocitária quando comparada ao grupo controle (C0). Conclui-se que a vitamina E não é capaz de promover aumento nas taxas de maturação oocitária de ovinos, mas não causa nenhum dano à célula em altas concentrações. A cafeína, quando utilizada na concentração de 5 mM reduz as taxas de fecundação in vitro de oócitos ovinos.

ABSTRACT

This study aimed to evaluat the effect of the use of vitamin E and caffeine at different stages of in vitro production of sheep embryos in the semiarid Northeast of Brazil. Were used sheep ovaries without defined breed, obtained from a local slaughterhouse in the city of Petrolina-PE, which were transported in 0.9% NaCl solution plus antibiotics (penicillin) at 33 ° C to 35 ° C until the Laboratory of Physiology and Biotechnology of Animal Reproduction - LAFIBRA, UNIVASF. The oocytes were obtained by follicular aspiration technique vacuum pump and screened and classified under a stereomicroscope. The best quality oocytes followed for the in vitro maturation (IVM), which were randomly divided into 4 groups Groups VE0, VE50, VE100 and VE200, containing 0, 50, 100 or 200 µM of vitamin E, respectively. The basic medium used for IVM was TCM-199 supplemented with 2,2 mg sodium bicarbonate, 5 mg of LH, FSH and 0.5 mg of 10% fetal bovine serum. The mature oocytes followed for in vitro fertilization (IVF), which were divided into 4 groups Group C0, C5, C10 and C20, containing 0, 5, 10 or 20 mM caffeine, respectively. The medium consisted of IVF-IVF SOF containing 40 g gentamicin sulfate, 10% sheep serum in estrus (NOS) and 1 mg of heparin concentration was adjusted to 1x106 sperm sperm / ml. The time used for co-cultivation of 22 hours, followed by further evaluating the presumptive zygotes. To compare the parameters between groups, analysis of variance (ANOVA) one way, then the completion of the Tukey test was used. The data in percent were submitted to Fisher's test or chi-square, using the statistical software ASSISTAT (2011). Comparisons were considered significant when P <0.05. There was no statistical difference (P> 0.05). Regarding the oocyte maturation rate was no statistical difference (P> 0.05) between groups supplemented with different concentrations of vitamin E. There was no significant difference between treatments for both degrees of pyknosis and retraction. There was no significant difference between groups (P> 0.05), however, the VE100 group had oocytes with heterogeneous staining. Through this evaluation, it was also observed that, within each treatment, there was a significant prevalence (P <0.05) of complex homogeneous cumulus oocytes when compared to the other categories (slightly heterogeneous and heterogeneous). The use of 5 mM (C5) of caffeine as sperm capacitation promoter ram semen for IVF reduced (P <0.05) oocyte fertilization rate when compared to the control group (C0). We conclude that vitamin E can not promote increase in oocyte maturation of sheep rates, but causes no damage to the cell in high concentrations. Caffeine, when used at a concentration of 5 mM reduce fertilization rates in vitro in ovine oocytes.