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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-202438

Resumo

O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de células e taxa de apoptose, assim como pela determinação da atividade das caspases. No experimento 1, a taxa de oócitos em metáfase II após 24h de MIV não foi afetada (P>0,05) pelos tratamentos (61,2%-74,7%). A expansão das células do cumulus foi maior (P<0,05) no grupo FF após as 6h e não diferiu entre os grupos ao final da MIV (4,8%-5,0%). A distribuição dos microfilamentos de actina na categoria difusa (37,4%) foi maior (P<0,05) após 6h de MIV no grupo MR quando comparado aos oócitos imaturos (6,4%) e ao grupo FF (8,1%), porém foi predominante na categoria normal e não diferiu (P>0,05) entre os grupos ao final da MIV (65,5%-84,2%). A distribuição citoplasmática de mitocôndrias foi predominantemente periférica (47,8%-73,3%) em oócitos imaturos e dispersa (77,7%-89,0%) após a MIV. O potencial de membrana mitocondrial foi semelhante (P>0,05) entre os grupos (148,3-168,1) após 6h e 24h de MIV os oócitos dos grupos C1 (231,9) e C2 (219,8) apresentaram maior (P<0,05) potencial de membrana mitocondrial quando comparados aos grupos MR (155,2) e FF (161,9), porém não diferiram de BL (189,5). A quantidade intracelular de ROS após 6h foi menor (P<0,05) no grupo BL (141,9) comparado com MR (160,8) e ambos foram semelhantes (P>0,05) aos demais tratamentos (145,8-153,7). A taxa de apoptose em oócitos imaturos (1,5%) e após o transporte (6h) no grupo C1 (1,3%) foi menor (P<0,05) quando comparados com MR (13,8%) e C2 (12,0%) e não diferiram (P>0,05) de BL (7,5%), CL (7,8%) e FF (7,1%), não houve diferença (P>0,05) na taxa de apoptose em oócitos maturos (2,3%-8,8%). No experimento 2, a taxa de clivagem foi maior (P<0,05) para o grupo Contr SFB (84,5%) quando comparada aos demais (59,6%-70,9%). O desenvolvimento embrionário do grupo Contr SFB (39,8%) foi maior (P<0,05) quando comparado a Contr Transp (22,6%) e MR (21,6%) e todos estes foram semelhantes (P>0,05) aos demais (23,6%-28,7%). O número total de células em embriões do grupo Contr SFB (85,2) foi maior (P<0,05) do que os dos grupos Contr BSA (53,6), Contr Transp (55,5), BL (58,3), CL (57,9) e MR (59,1), e todos foram semelhantes (P>0,05) ao grupo FF (67,7). A taxa de apoptose avaliada pelo ensaio TUNEL não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos (12,3%-15,7%), assim como a atividade das caspases que não apresentou diferença (P>0,05) entre os grupos experimentais (139,0-152,4). A adição de inibidores da meiose (butirolactona-I, IBMX associado à forskolina e fluido folicular), com exceção da milrinona, ao meio de transporte de oócitos bovinos permite um transporte adequado por 6h, preservando a qualidade e integridade dos oócitos, permitindo uma produção embrionária semelhante à obtida in vitro a partir de oócitos que não foram submetidos ao transporte.

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The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspase activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8-5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM (65.5%-84.2%). Mitochondrial cytoplasmic distribution was mosty peripheral (47.8%-73.3%) in immature oocytes and disperse (77.7%-89.0%) after IVM. There were no differences (P>0.05) in mitochondrial membrane potential after 6h (148.3-168.1) and after IVM it was higher (P<0.05) in C1 (231.9) and C2 (219.8) when compared to MR (155.2) and FF (161.9), but did not differ (P>0.05) from BL (189.5). Intracellular amounts of ROS after 6h was lower (P<0.05) in BL (141.9) than in MR (160.8) and both were similar (P>0.05) to the others. Apoptosis rate in immature oocytes (1.5%) and after 6h in C1 (1.3%) was lower (P<0.05) than MR (13.8%) and C2 (12.0%) and did not differ (P>0.05) from BL (7.5%), CL (7.8%) and FF (7.1%). In mature oocytes, there were no differences (P>0.05) in apoptosis rates. In experiment 2, cleavage rates was higher (P>0.05) for Contr FCS group (84.5%) when compared to the others (59.6%-70.9%). Embryo development was higher (P<0.05) in Contr FCS (39.8%) in comparison to Contr Transp (22.6%) and MR (21.6%), and those were similar (P>0.05) to the others (23.6%-28.7%). Total cell number in embryos from the group Contr SFB (85.2%) was higher (P<0.05) than Contr BSA (53.6%), Contr Transp (55.5%), BL (58.3%), CL (57.9%) and MR (59.1%), and they did not differ from FF (67.7%). TUNEL evaluation of apoptosis did not differ (P>0.05) between treatments (12.3%-15.7%), and the caspases activity (139.0-152.4) did not differ (P>0.05). The addition of meiotic inhibitors (butyrolactone-I, IBMX associated to forskolin and follicular fluid), with exception of milrinone, for the transport medium of bovine oocytes allows an adequate transport for 6h, preserving the quality and integrity of oocytes, promoting an embryo production similar to that obtained in vitro by oocytes that were not submitted to transport.

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