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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203018

Resumo

A rutina é um flavonoide e seu potencial antioxidante já foi demonstrado em diferentes tipos celulares. Entretanto, ainda não há informações sobre o efeito antioxidante da rutina no cultivo in vitro de folículos secundários ovinos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da rutina como único suplemento antioxidante, adicionado ao meio de base, sobre o cultivo in vitro de folículos secundários isolados de ovários ovinos. Folículos secundários (n= 55-61) ovinos, com diâmetro em torno de 200 m, foram cultivados individualmente em gotas de 100 L, durante 12 dias, à 39°C, em -Meio Essencial Mínimo (-MEM) suplementado com 3,0 mg/mL BSA, 10 ng/mL insulina, 2 mM glutamina e 2 mM hipoxantina (meio livre de antioxidantes, denominado de -MEM) ou neste mesmo meio adicionado ainda de 5,5 g/mL transferrina, 5,0 ng/mL selênio e 50 g/mL ácido ascórbico (AO). Para avaliar o efeito antioxidante da rutina, aos diferentes meios de base, com ou sem antioxidantes (-MEM ou AO), foram adicionados diferentes concentrações de rutina (0,1; 1 ou 10 g). A cada 6 dias, os folículos foram avaliados quanto aos aspectos morfológicos (folículos normais, formação de antro e diâmetro folicular). Ao final do cultivo, determinou-se a percentagem de oócitos totalmente crescidos (oócitos >110 m). Nos tratamentos que obtiveram os melhores resultados de morfologia, foram avaliados a viabilidade folicular, através dos marcadores fluorescentes calceína-AM e etídio-homodímero 1, apoptose folicular através da técnica de TUNEL e os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa (GSH) e mitocôndrias ativas. As taxas de folículos normais, formação de antro, viabilidade e oócitos >110 m foram comparadas pelo Qui-quadrado. Os dados de diâmetro folicular, taxa de crescimento, foram submetidos ao Shapiro-Wilk seguido do teste de Kruskal-Wallis; e comparados pelo Student Newman Keuls. A apoptose foi avaliada pelo teste de Fisher. Níveis de EROs, GSH e mitocôndrias ativas foram submetidos a ANOVA (P<0,05). Os resultados mostraram que após 12 dias de cultivo, os meios AO e -MEM (sem antioxidante) acrescido de 0,1 g de rutina apresentaram porcentagens de folículos normais superiores (p<0,05) quando comparados aos demais tratamentos. Não houve diferenças (p>0,05) no diâmetro e na taxa de crescimento. Além disso, AO e -MEM acrescido de 0,1 g de rutina apresentaram porcentagem de viabilidade folicular, formação de antro, oócitos totalmente crescidos, níveis de EROs e mitocôndrias ativas semelhantes (p>0,05). No entanto, o tratamento -MEM adicionado de 0,1 g de rutina apresentou níveis de GSH superiores quando comparado ao AO. Em conclusão, na concentração de 0,1 g, a rutina pode ser utilizada como o único antioxidante presente no meio de base para o cultivo in vitro de folículos secundários ovinos, mantendo a viabilidade folicular e aumentando os níveis de GSH.

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Rutin is a flavonoid that acts as a potent antioxidant in different cells types. However, there is no information about the effect of the antioxidant rutin on the in vitro culture of ovine secondary follicles. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of rutin as the only antioxidant added to the base medium on the in vitro culture of ovine isolated secondary follicles. Sheep secondary follicles (n= 55-61), approximately 200 m, were individually cultured in 100 L drops, during 12 days, at 39°C, in -Minimal Essential Medium (-MEM) supplemented with 3.0 mg/mL BSA, 10 ng/mL insulin, 2 mM glutamine and 2 mM hypoxanthine (antioxidant free-medium, called -MEM) or in this medium also added by 5.5 g/mL transferrin, 5.0 ng/mL selenium and 50 g/mL ascorbic acid (AO). To evaluate the effect of rutin, different concentrations of this antioxidant (0,1; 1 ou 10 M) were added to the different base media, with or without antioxidant (-MEM or AO). At each 6 days, morphological aspects were analyzed (normal follicles, antrum formation and follicular diameter). At the end of culture, the percentage of fully-grown oocytes (oocytes >110 m) was evaluated. In treatments that had the best results of morphology, other parameters were analyzed, such as follicular viability through the fluorescent markers calcein-AM and ethidium homodimer 1, and intracellular levels of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH) and active mitochondria. The rates of normal follicles, antrum formation, viability and oocytes >110 m were compared by Qui-square test. Data from follicular diameter, growth rate, levels were submitted to Shapiro-Wilk followed by Kruskal-Wallis; and compared by Student Newman Keuls. Apoptosis was evaluated by Fisher's test. ROS levels, GSH and active mitochondria were subjected to ANOVA (P<0.05). The results showed that after 12 days of culture, AO and -MEM (without antioxidant) added by 0,1 M rutin had higher percentages of normal follicles (p<0.05) than other treatments. There is no difference (p>0.05) in the diameter and growth rate. Moreover, AO and -MEM added by 0,1 M rutin showed similar (p>0.05) percentages of follicular viability, antrum formation, fully-grown oocytes, levels of ROS and active mitochondria. However, treatment -MEM added by 0,1 M rutin showed higher GSH levels than AO . In conclusion, at a concentration of 0,1 M, rutin can be used as the only antioxidant present in base medium for in vitro culture of ovine secondary follicles, maintaining follicular viability and increasing GSH levels.

Biblioteca responsável: BR68.1