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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203170

Resumo

A caprinocultura leiteira vem ganhando destaque nos últimos anos impulsionado por incentivos governamentais e privados. Em contrapartida, a mastite acarreta representa grandes perdas econômicas no segmento leiteiro tanto na quantidade como na qualidade do leite produzido. Foi realizado um estudo da mastite subclínica em nove rebanhos de cabras leiteiras localizadas no Estado do Rio de Janeiro, totalizando 140 amostras de leite (uma amostras por animal), com o objetivo de avaliar a qualidade do leite de cabra pelo cultivo microbiológico e reação em cadeia da polimerase (PCR) do leite in natura para pesquisa de Staphylococcus aureus, contagem de células somáticas (CCS), contagem bacteriana total (CBT), análises físico-química, verificação do perfil de resistência antimicrobiana in vitro de Staphylococcus spp., detecção de genes de resistência a beta-lactâmicos e a presença de resíduos antimicrobianos. Houve crescimento bacteriano em 64 amostras (48%), dentre essas 10 obtiveram isolamento de dois microrganismos associados. Dos 77 isolados encontrados, 58,4% foram identificados como Staphylococcus coagulase negativa (SCN), 11,58% Staphylococcus Coagulase Positiva, 14,16% bastonetes gram negativos da família das enterobactérias (incluindo E. coli e Serratia sp.), 6,49% Bacillus spp., 5,19% Streptococcus spp. e 3,89% Enterococcus spp. A associação de SCN e bastonete gram negativo apresentou o maior número, com 50%, seguido de 20% Staphylococcus Coagulase Positiva + Enterococcus sp. e 10% SCN + Bacillus spp., Streptococcus spp. + Bacillus spp. e Streptococcus spp. + Bastonete Gram Negativo. No teste de difusão em disco realizado com 54 isolados de Staphylococcus spp., o antimicrobiano mais efetivo foi o florfenicol (1,7%) e as maiores resistências foram para ampicilina e penicilina (50%), seguida da oxacilina (32,70% ), tetraciclina (8,60%), cefoxitina( 6,89%), norfloxacina (5%), gentamicina e cefalotina (3,40%). A múltipla re¬sistência a dois ou mais antimicrobianos foi observada em 57,40% dos isolados. Nenhuma amostra de leite obteve positividade para Staphylococcus aureus no cultivo e na PCR. A média de CCS de 2.152.000 células/mL está acima do recomendado pela literatura. Não houve associação significativa entre o isolamento bacteriano e os valores obtidos na contagem de células somáticas (t-Student p > 0,05). A média de CBT de 842.000 UFC/mL de leite foi acima do preconizado pela legislação. As análises físico-químicas realizadas no leite foram: porcentagens de gordura, proteína e lactose por absorção infravermelha, bem como de sólidos totais, por soma dos valores dos componentes anteriores. A acidez, pela titulação de leite por solução alcalina (NaOH 0,1N), utilizando-se como indicador a fenolftaleína e o resultado expresso em graus Dornic (°D). A determinação de cloretos pelo método mercurométrico e densidade a 15°C em aparelho eletrônico. Alguns rebanhos não atenderam aos padrões físico-químicos exigidos pela legislação. A acidez apresentou diferença significativa quando associada ao isolamento bacteriano (p<0,05). O risco (odds ratio) de detecção bacteriana em caso de acidez elevada aumentado em 1,15 vezes quando comparado a amostras com acidez normal. A contribuição de todos os fatores físico-químicos a CBT somou 41,08%, sendo a lactose o fator que mais contribuiu isoladamente (p<0,05). Em dezenove amostras isoladas de mastite caprina subclínica dos mesmos rebanhos estudados, foi realizada a técnica proteômica MALDI-TOF para identificação das espécies; detecção fenotípica de resistência aos beta-lactâmicos pela difusão em disco simples de oxacilina, cefoxitina, penicilina G e amoxacilina + ácido clavulânico, ágar screen de oxacilina e microdiluição em caldo (MIC) de cefoxitina, e a detecção de genes de resistência à oxacilina de Staphylococcus spp. através da PCR para amplificação dos genes: mecA (MURAKAMI et al. 1991), mecA variante (MELO et al. 2014), mecI (LENCASTRE; OLIVEIRA 2002), mecRI (ROSATO et al. 2003), mecC (STEEGER et al. 2012) e blaZ (ROSATO et al. 2003). Foram identificadas como Staphylococcus epidermidis 47,36%, 15,78% como Staphylococcus warneri, 10,52% como Staphylococcus caprae e Staphylococcus aureus e 5,26% tanto para Staphylococcus lugdunensis, como para Staphylococcus simulans e Staphylococcus cohnii. Os isolados caracterizados pelo MALDI-TOF foram confirmados como Staphylococcus spp. pela PCR para o gene 16rRNA. O teste de difusão em disco demonstrou resistência de 58% para penicilina G e 26,31% tanto para cefoxitina como para oxacilina. Todas as amostras foram sensíveis a amoxicilina + ácido clavulânico e ao ágar screen de oxacilina. À MIC, 63,15% das amostras foram resistentes a cefoxitina, sendo que 52,63% com MIC 8,0 µg/ml e 10,52% com MIC 16 µg/ml. Duas amostras de Staphylococcus epidermidis apresentaram o gene mecA proposto por Murakami et al. (1991). Todos os isolados foram negativos para o gene mecA variante (MELO et. al, 2014), mecl, mecRI mecC e blaZ. Nenhuma amostra apresentou resíduo acima dos limites máximos permitidos. SCN foi o agente bacteriano isolado com maior frequência e a resistência antimicrobiana dessas cepas frente a ampicilina, penicilina e oxacilina, alertam para alterações do perfil de sensibilidade destes patógenos ao longo dos anos. A elevada taxa de resistência fenotípica acompanhada por uma baixa detecção genotípica nos isolados de Staphylococcus spp., pode estar relacionada a alterações nos genes desencadeadas por mutações, fagos, plasmídeos e transposons. Tais achados reforçam a importância deste grupo de microrganismos na etiologia da mastite subclínica em caprinos e abre perspectivas para futuras pesquisas para a investigação da epidemiologia da doença. A CCS não se correlaciona com os resultados do isolamento bacteriano, devendo ser avaliada com cautela em estudos sobre mastite subclínica em cabras. Esse estudo demonstra a importância e a necessidade de um monitoramento constante por parte dos órgãos responsáveis e por instituições de pesquisa quanto a qualidade e a integridade do leite de cabra que é fornecido a população.

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Dairy goat is growing in recent years driven by government and private incentives. In contrast, mastitis leads is great economic losses in the dairy segment in both the quantity and quality of milk produced. A study of subclinical mastitis in nine herds of dairy goats in the state of Rio de Janeiro, totaling 140 samples of milk, in order to assess the quality of goat milk by microbiological culture and polymerase chain reaction (PCR) was performed of fresh milk for Staphylococcus aureus research, somatic cell count (SCC), total bacterial count (TBC), physico-chemical analysis, check in antimicrobial resistance profile vitro Staphylococcus spp., detection of beta-resistance genes lactam and the presence of antimicrobial residues. Bacterial growth in 64 samples (48%), of these 10 were obtained isolating two associated micro-organisms. Of the 77 isolates found, 58.4% were identified as coagulase negative Staphylococcus (CNS), 11.58% coagulase positive Staphylococcus, 14.16% negative rods gram of the Family Enterobacteriaceae (including E. coli and Serratia sp.), 6 49% Bacillus spp., Streptococcus spp 5.19%. and 3.89% Enterococcus spp. he combination of CNS and gram negative rod had the highest number with 50%, followed by 20% Staphylococcus coagulase positive + Enterococcus sp. SCN + 10% Bacillus spp., Streptococcus spp. + Bacillus spp. and Streptococcus spp. + Gram Negative Bacillus. In the disc diffusion test with 54 Staphylococcus spp., more effective antibiotic florfenicol was (1.7%) and the greatest resistance to ampicillin and penicillin were (50%), followed by oxacillin (32.70%), tetracycline (8.60%), cefoxitin (6.89%), norfloxacin (5%), gentamicin and cephalothin (3.40%). Multiple resistência to two or more antibiotics was observed in 57.40% of the isolates. No milk sample obtained positive for Staphylococcus aureus in culture and PCR. The SCC average of 2,152,000 cells/mL is above the recommended by the literature. There was no significant association between bacterial isolation and the values obtained in the SCC (Student t p> 0.05). The average TBC 842,000 CFU/ml of milk was higher than recommended by law. The physico-chemical analyzes in milk were: percentage of fat, protein and lactose infrared absorption, as well as total solids, by summing the values of the above components. The acidity by titration milk alkaline solution (0.1N NaOH), using phenolphthalein as an indicator and Dornic result expressed in degrees (°D). The determination of chloride by method mercurométrico and density at 15°C in electronics. Some herds did not meet the physical and chemical standards required by law. Acidity significant difference when associated with bacterial isolation (p <0.05). The risk (odds ratio) of bacterial detection in case of high acidity increased by 1.15 times as compared to samples with normal acidity. The contribution of all physicochemical factors TBC amounted to 41.08%, the lactose factor that contributed alone (p <0.05). In nineteen samples isolated from subclinical mastitis goat herds of the same study, proteomics technique MALDI-TOF was performed to identify the species; Phenotypic detection of resistance to beta-lactams by diffusion in simple disk oxacillin, cefoxitin, penicillin G and amoxicillin plus clavulanic acid, agar "screen" oxacillin and microdilution (MIC) of cefoxitin, and detection of resistance genes oxacillin of Staphylococcus spp. by PCR amplification of genes: mecA (MURAKAMI et al 1991.), mecA variant (MELO et al 2014.) mecI (LANCASTEr; OLIVEIRA 2002), mecRI (ROSATO et al., 2003), mecC (STEEGER et al. 2012) and blaZ (ROSATO et al. 2003). They were identified as Staphylococcus epidermidis 47.36% 15.78% as Staphylococcus warneri, Staphylococcus caprae as 10.52% and 5.26% Staphylococcus aureus and Staphylococcus lugdunensis so as Staphylococcus simulans and Staphylococcus cohnii. Isolates characterized by MALDI-TOF were confirmed as Staphylococcus spp. by PCR for 16S rRNA gene. The disk diffusion test demonstrated resistance to penicillin G, 58% and 26.31% for both the cefoxitin and for oxacillin. All strains were susceptible to amoxicillin + clavulanic acid and agar "screen" oxacillin. The MIC, 63.15% of the samples were resistant to cefoxitin, and 52.63% with MIC 8.0 g / ml and 10.52% with MIC 16 mg / ml. Two samples of Staphylococcus epidermidis mecA gene had proposed by Murakami et al. (1991). All isolates were negative for the mecA gene variant (MELO et al., 2014), mecl, mecRI mecC and blaZ. No samples showed residue above the maximum allowable limits. CNS was isolated bacterial agent with greater frequency and antimicrobial resistance across these strains to ampicillin, penicillin and oxacillin, warn sensitivity profile of these pathogens changes over the years. The high phenotypic resistance rate accompanied by a low genotypic detection in Staphylococcus spp., may be related to alterations in gene triggered by mutation, phage, plasmids and transposons. These findings reinforce the importance of this group of microorganisms in the etiology of subclinical mastitis in goats and opens perspectives for future research to investigate the epidemiology of the disease. The SCC is not correlated with the results of bacteriological isolation, and must be carefully evaluated in studies of subclinical mastitis in goats. This study demonstrates the importance and the need for constant monitoring by the responsible agencies and research institutions and the quality and integrity of goat milk that the population is provided.

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