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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203233

Resumo

Relatos indicam que as aquaporinas (AQPs), em especial a AQP3, podem estar envolvidas no processo de formação do antro em folículos ovarianos, no entanto, essa informação ainda não foi completamente comprovada. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar a participação da AQP3 no desenvolvimento de folículos ovarianos ovinos cultivados in vitro, após o silenciamento gênico pós-transcricional (SGPT) ou knockdown para o mRNA dessa proteína. Inicialmente, foi desenvolvido um protocolo de transfecção utilizando o complexo de transfecção (CT) Lipofectamine® (volumes: 0,5; 0,75 ou 1,0 l) + o oligonucleotídio fluorescente BLOCK-iT (concentrações: 18,03; 27,12 ou 36,16 nM), por diferemtes tempos de incubação (12, 14, 16, 18 or 20 h). Os resultados mostraram que as melhores condições de transfecção foram 0,75 l de Lipofectamine® + 27,12 nM de BLOCK-iT incubando-se por 12 h. O knockdown da AQP3 foi realizado substituindo o BLOCK-iT pelo siRNA-AQP3 no CT. Folículos secundários foram distribuídos aleatoriamente em grupos: Controle não-transfectados (CD3 e CD6), transfectados com siRNA inespecífico (Negative Control Transfection - tNEG) ou com siRNA-AQP3 nos dias 0 (t0D3 ou t0D6), 3 (t3D6) ou 0 e 3 (t0/3D6) e então cultivados in vitro por 3 ou 6 dias. Após o cultivo, os folículos foram submetidos às avaliações: expressão gênica e proteica, integridade e extrusão e ainda o desenvolvimento folicular (crescimento, diâmetro e formação da cavidade antral). A AQP3 foi imunolocalizada em todas as estruturas foliculares, embora a expressão gênica em folículos transfectados e cultivados tenha sido menor que a de folículos antrais obtido in vivo. As taxas de folículos íntegros (t3D6 e t0/3D6) e formação de antro (t0/3D6) foram maiores em folículos transfectados do que a de folículos não transfectados. A taxa de folículos extrusos foi maior nos tratamentos CD6 e t0D6, enquanto que o tratamento t3D6 apresentou maior taxa de crescimento diário. Além disso, folículos dos tratamentos transfectados t3D6 e t0/3D6 apresentaram maior velocidade de crescimento folicular. Em conclusão, esse trabalho mostrou que é possível transfectar com sucesso, folículos secundários ovinos usando a técnica de siRNA e que essa técnica reduz a taxa de formação do antro em folículos secundários cultivados in vitro. Essa é maius uma evidência de que a AQP3 tem participação na formação da cavidade antral.

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Reports indicate that aquaporins (AQPs), in particular AQP3 may be involved in the training event antral follicles cavity. However, the participation of this protein has not been fully elucidated. Techniques for post-transcriptional gene silencing (knockdown) are important tools and have been used to elucidate the function of proteins during folliculogenesis. Therefore, this study investigated the participation of AQP3 in the development of secondary follicles sheep after the knockdown in vitro culture. First transfection tests were performed with Lipofectamine® and BLOCK-iT fluorescent oligonucleotídio complex (transfection complex) in three different volumes (0.5, 0.75 or 1.0 l) and concentrations (18.03, 27.12 or 36.16 nM), respectively, and incubation times (12, 14, 16, 18 or 20 h). Tests showed that the best conditions for transfection were 0.75 l of Lipofectamine®, 27.12 nM BLOCK-iT and incubated for 12 h. The knockdown AQP3 occurred replacing the BLOCK-iT by siRNA-AQP3. Follicles side sheep were randomly allocated to non-transfected groups (CD3 and CD6) or transfected groups on days 0 (tNEG, t0D3, t0D6), 3 (t3D6) or 0 3 (t0/3D6) and cultured in vitro over 3 or 6 days. The follicles were evaluated by quantitative PCR techniques, immunohistochemistry, western blotting and the integrity analyzes, antrum formation and follicular growth. The test results showed that it is possible to successfully transfect secondary follicles sheep, and the transfection complex can cross the basement membrane barrier, granulosa cells and oocyte reach, according to the fluorescence emission by the follicles. The AQP3 was imunolocalized in all follicular structures although gene expression in transfected and cultured follicles was lower than the in vivo antral follicles. Protein expression was not detected in any treatment. The rates of intact follicles (t3D6 and t0/3D6) and antrum formation (t0/3D6) were higher in transfected follicles, the extruded follicles was higher in treatments (CD6 and t0D6) and t3D6 treatment showed the highest daily growth. In addition, treatments follicles transfected t3D6 and t0/3D6 showed a higher rate of follicular growth. In conclusion, this study showed more evidence that AQP3 possibly participates in the formation of antral cavity.

Biblioteca responsável: BR68.1