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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203321

Resumo

A hepatite E (HE) é uma doença infecciosa causada pelo vírus da hepatite E (HEV). Este patógeno pode ser transmitido através da água, alimentos contaminados, transfusão sanguínea e transplantes de órgãos sólidos oriundos de doadores infectados. Infecções causadas pelo HEV são notificadas mundialmente e, todos os anos, milhares de pessoas morrem por consequência da HE, convertendo esta enfermidade em um importante problema de saúde pública. Neste trabalho, descrevemos o desenvolvimento de um ELISA indireto baseado na proteína recombinante ORF-2 capaz de detectar anticorpos humanos anti-HEV genótipo 3. Apresentamos também, o perfil sorológico (IgGs anti-HEV) de doadores de sangue do Estado do Rio Grande do Sul. Com relação ao desenvolvimento do ELISA, avaliou-se a capacidade de dois tipos de microplacas de ELISA (MaxiSorp®e PolySorp®,Sigma-Aldrich, EUA) de adsorver a proteína recombinante ORF-2; definiu-se a concentração ideal do antígeno sensibilizante; determinou-se a diluição de trabalho dos antissoros humanos e, por último, procedeuse a validação do ELISA in house com um Kit comercial (RecomWell anti-HEV IgG, Mikrogen®,Alemanha) amplamente utilizado para o diagnóstico sorológico de HE. Os resultados deste trabalho demonstram que a proteína ORF-2 foi significativamente melhor adsorvida na microplaca MaxiSorp®. Durante a avaliação das duas microplacas, observamos que o coeficiente de variação interno da microplaca MaxiSorp®foi menor (mais constante) e, que sua relação P/N foi 76,61% superior quando comparado com os valores advertidos na microplaca PolySorp®(1,24 e 0,29, respectivamente), garantido maior resolução à reação sorológica. A quantidade ótima de antígeno por cavidade da microplaca foi determinado em 0,67 g e, a diluição do antissoro primário em 1:100. A análise comparativa do ELISA in house com o ELISA comercial revelou uma concordância de 94% (índice Kappa de 0.87). Após a padronização do ELISA in house, 780 amostras de soros humanos procedentes de doadores de sangue da região norte do Estado do Rio Grande do Sul, foram analisadas. Surpreendentemente, 314 doadores apresentaram IgGs anti-HEV genótipo 3, perfazendo uma prevalência de positividade na população estudada de 40.25%. Em síntese, este trabalho descreve o desenvolvimento de um Kit de diagnóstico sorológico genuinamente nacional para detectar anticorpos humanos anti-HEV e sugere, pela alta prevalência de positividade encontrada, que a região norte do estado do Rio Grande do Sul seja endêmica para o Vírus da Hepatite E.

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The Hepatitis E (HE) is an infectious disease caused by Hepatitis E Virus (HEV). This pathogen can be transmitted through water, contaminated food, blood transfusion, and solid organ transplants come from infected donors. Infections caused by HEV are globally notified and, every year, thousands of people die as a consequence of HE, making this disease an important public health problem. Here we describe the development of an indirect ELISA based on a recombinant protein ORF-2 capable of detecting human antibodies anti-HEV genotype 3. We also present the serologic profile (IgGs anti-HEV) of blood donors from the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Regarding to the development of ELISA, it was assessed the capacity of two types of ELISA microplates (MaxiSorp® e PolySorp®) to adsorb the recombinant ORF-2 protein; the ideal concentration of sensitizing antigen was established; It was defined the work dilution of human antisera and, finally proceeded the validation of ELISA in house with a commercial Kit (RecomWell anti-HEV IgG, Mikrogen®) widely used for serologic diagnostic of HE. These results showed that ORF-2 protein was significantly better adsorbed in MaxiSorp®microplate. During the evaluation of two microplates, we observe that the internal variation coefficient of the MaxiSorp® microplate was less (more constant) and, your relation P/N was 76,61% higher than the values of PolySorp®(1,24 e 0,29, respectively), ensuring higher resolution of serologic reaction. The optimal amount of antigen by well was determined in 0,67 g and, the primary antisera dilution was 1:100. The comparative analyze of the ELISA in house with commercial ELISA showed a concordance of 94% (Kappa index of 0.87). After the standardization of the ELISA in house, 780 samples of human sera from healthy blood donors from north region of State of Rio Grande do Sul, was analyzed. Interestingly, 314 donors presented IgG anti-HEV genotype 3, giving a prevalence of positivity in the target population of 40.25%. In summary, this work describes the development of genuine national serologic diagnostic kit for detection of human antibodies anti-HEV and suggests, by the higher prevalence of positivity founds, that the north region of State of Rio Grande do Sul is endemic for the Hepatitis E Virus.

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