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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203373

Resumo

Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar a eficiência de dois meios de cultivo desenvolvidos para camundongos e caprinos sobre o cultivo in vitro de folículos pré-antrais isolados de ambas as espécies; 2) investigar a expressão do hormônio anti-mülleriano (AMH) e seu receptor do tipo II (AMHRII) em ovários caprinos e verificar os efeitos do AMH e do kit ligand (KL) sobre os parâmetros de sobrevivência, ativação e crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in situ; 3) avaliar os efeitos do AMH, associado ou não ao hormônio folículo estimulante (FSH), sobre a sobrevivência, crescimento folicular e competência para a retomada da meiose de oócitos oriundos de folículos secundários caprinos isolados cultivados in vitro, bem como avaliar os níveis de secreção de esteroides e de mRNA para o AMH, AMHRII, receptor de FSH (FSHR), enzimas esteroidogênicas (CYP19A1, CYP17, HSD3B), e Myc. Para o cultivo in situ, fragmentos de córtex ovariano foram cultivados in vitro por 1 ou 7 dias em -MEM+ sozinho ou adicionado de AMH ou KL. Para o cultivo de folículos isolados, folículos secundários foram isolados por microdissecção e cultivados por 12 (camundongo) ou 18 (caprino) dias em -MEM+. Para a comparação entre os meios desenvolvidos para camundongos e caprinos, o meio de cultivo foi suplementado com FSH recombinante humano (meio camundongo) ou com FSH recombinante bovino associado ao hormônio do crescimento (meio caprino). Já a comparação entre os efeitos do AMH associado ou não ao FSH durante o cultivo de folículos caprinos isolados, o -MEM+ foi suplementado ou não com AMH e/ou FSH adicionados ou não de forma sequencial. Os resultados demonstraram que, após a maturação in vitro, um alto (P < 0,05) número de oócitos retomaram a meiose no meio murino em ambas as espécies estudadas. Em contraste, somente na espécie caprina a produção de estradiol foi significativamente superior quando o meio caprino foi usado. Após 7 dias de cultivo in situ, a adição de AMH manteve o percentual de folículos em desenvolvimento, similar ao encontrado no controle não-cultivado. Além disso, o AMH e o seu receptor foram localizados em oócitos e células da granulosa desde folículos primordiais até folículos antrais. Quanto ao cultivo de folículos caprinos isolados, os tratamentos AMH, AMH + FSH e AMH/FSH reduziram (P < 0,05) a taxa de crescimento quando comparados ao controle cultivado (-MEM+) e ao FSH sozinho. No entanto, as condições de cultivo testadas não afetaram as taxas de retomada da meiose e a produção de esteroides (P > 0,05). A expressão de mRNA para AMHRII foi reduzida (P < 0,05) na presença do FSH em comparação ao controle não-cultivado e os tratamentos que continham AMH e AMH/FSH. Em conclusão, folículos pré-antrais murinos e caprinos cultivados sob as mesmas condições de cultivo in vitro respondem diferentemente. Além disso, o AMH inibe a ativação de folículos primordiais caprinos cultivados em fragmentos de tecido ovariano e reduz a taxa de crescimento de folículos secundários caprinos isolados sem afetar a sobrevivência e a habilidade dos oócitos de retomarem a meiose.

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The aims of this study were: 1) to evaluate the efficiency of using two culture media developed for mice and goats during in vitro preantral follicle culture of each species; 2) to investigate the expression of the anti-Müllerian hormone (AMH) and its type II receptor (AMHRII) in goat ovaries and to verify the effects of AMH and kit ligand (KL) on the survival, activation and growth of caprine preantral follicles cultured in situ; 3) to evaluate the effects of AMH, associated or not with follicle-stimulating hormone (FSH), on the follicular survival, growth and competence of oocytes for meiosis resumption after culture of isolated caprine secondary follicles cultured in vitro, as well as to assess the levels of steroids secretion and of mRNA for AMH, AMHRII, FSH receptor (FSHR), steroidogenic enzymes (CYP19A1, CYP17, HSD3B), and Myc. For the in situ culture, ovarian fragments were in vitro cultured for 1 or 7 days in -MEM+ alone or added of AMH or kit ligand (KL). For the culture of isolated follicles, secondary follicles were isolated by microdissection and cultured for 12 (mice) or 18 (goat) days in -MEM+. For the comparison between the media developed for mice and goats, the culture medium was supplemented with human recombinant FSH (murine medium) or with bovine recombinant FSH in association with growth hormone (caprine medium). To compare the effects of AMH, associated or not to FSH during culture of isolated caprine follicles, the -MEM+ was supplemented or not with AMH and/or FSH added or not sequentially. The results showed that, after in vitro maturation, a higher (P < 0.05) number of oocytes that resumed meiosis were observed in the murine medium for both species. In contrast, only in the caprine species estradiol production was significantly superior when the caprine medium was used. After 7 days of in situ culture, addition of AMH maintained the percentage of developing follicles similar to that in the uncultured control. Moreover, AMH and its receptor were localized in oocytes and granulosa cells from the primordial follicle to antral follicle stages. Regarding the culture of isolated caprine follicles, AMH, AMH + FSH and AMH/FSH treatments showed a decrease in growth rate as compared to cultured control (-MEM+) and FSH (P < 0.05). However, the tested culture conditions did not affect meiosis resumption rates and steroids secretion (P > 0.05). The mRNA expression for AMHRII was decreased (P < 0.05) by the addition of FSH in comparison with non-cultured control, AMH and AMH/FSH treatments. In conclusion, murine and caprine preantral follicles cultured under the same in vitro culture medium conditions respond differently. Furthermore, AMH inhibits the activation of caprine primordial follicles cultured in situ and reduces follicular growth rate of goat isolated secondary follicles without affecting follicular survival, as well as the ability of oocytes to resume meiosis.

Biblioteca responsável: BR68.1