Estudos Experimentais de Plasmodium juxtanucleare Versiane e Gomes, 1941 em Gallus gallus utilizando as técnicas microscópicas e moleculares com ênfase na padronização de PCR em tempo real para o diagnóstico

RESUMO

Este estudo teve como objetivo desenvolver um ensaio de PCR em tempo real (qPCR) para o diagnóstico de Plasmodium spp. utilizando os genes 18S rDNA e citocromo b. Foram coletadas 101 amostras de sangue de aves da espécie Gallus gallus de criação rústica ou orgânica no município de Seropédica, Rio de Janeiro. Os sangues coletados foram utilizados na preparação de esfregaços de sangue e para extração do ácido desoxirribonucléico (DNA) destas amostras. Protocolos de ensaios moleculares foram testados, tal como o PCR convencional (cPCR) e nestedPCR (nPCR) para Plasmodium spp. Neste estudo dois protocolos de qPCR foram desenvolvidos utilizando oligoiniciadores desenhados com alvo no citocromo b e 18S rDNA. O limite de detecção para os dois genes qPCR foi de 10 cópias do alvo de DNA, que foram maiores do que o limite de detecção observado em nPCR e cPCR. Em qPCR, 69,30% (n = 70/101) amostras foram positivas com alvo no gene 18SrDNA e 59,40%(n = 60/101) amostras positivas com alvo no gene citocromo b. Em nPCR e cPCR, 54,45% (n = 55/101) e 52,47% (n = 53/101) amostras foram positivas, respectivamente. Em microscopia de esfregaço de sangue, 31 (30,69%) amostras foram positivas. Não houve discordância entre os resultados (p> 0,05) de qPCR para os genes 18SrDNA e citocromo. Além disso, qPCR foi mais sensível do que as outras técnicas discutidas, principalmente relacionado com a microscopia óptica (p <0,05). Portanto, os dois ensaios de qPCR desenvolvidos neste estudo mostraram mais sensibilidade do que outras técnicas e permitiu a detecção de Plasmodium spp. em aves de criação rústica mesmo com baixa parasitemia.

ABSTRACT

This study aimed to develop a real-time PCR (qPCR) assay for diagnosis of Plasmodium spp. using as target the 18S rDNA and Cytochrome b genes. A range of 101 blood samples were collected from Gallus gallus in poultry rustic breeds of in Rio de Janeiro, Brazil. The collected bloods were used to prepare blood smears and to extract the deoxyribonucleic acid (DNA) of these samples. There with, molecular protocols were tested, such as the already published conventional PCR (cPCR) and nested PCR (nPCR), designed for Plasmodium spp. In this study two qPCR protocols were developed using primers targeting the Cytochrome b and 18S rDNA genes. The qPCR detection limit for both genes was 10 copies of the target DNA, which were higher than the detection limit observed in nPCR and cPCR. In qPCR, 69.30% (n = 70/101) samples were positive targeting 18Sr DNA gene and 59.40% (n = 60/101) samples were positive targeting Cytochrome b gene. In nPCR and cPCR, 54.45% (n = 55/101) and 52.47% (n= 53/101) samples were positive, respectively. In blood smear microscopy, 31 (30.69%) samples were positive. There was no disagreement between the results (p > 0.05) of qPCR for 18Sr DNA and Cytochrome b genes. Additionally, qPCR was more sensitive than the other techniques discussed, mostly related to blood smear microscopy (p < 0.05). Therefore, the two qPCR developed in the study showed more sensitivity than other techniques and enabled the detection of Plasmodium spp. in poultry even in low parasitemia.