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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203753

Resumo

A investigação do hábito alimentar de flebotomíneos tem grande significado ecológico e epidemiológico. Diferentes metodologias, incluindo uso de técnicas sorológicas, foram utilizadas para identificação das fontes de repasto. Contudo, abordagens moleculares com elevada sensibilidade e especificidade têm se sobressaído como importantes ferramentas nessa área. Estratégias de amplificação de genes mitocondriais, como o citocromo b, através de PCR convencional ou PCR em tempo real vêm sendo empregadas com elevados índices de detecção. No entanto, a inadequada especificidade das abordagens de amplificação gênica empregadas demanda a utilização conjunta de técnicas auxiliares que contribuem para aumentar o tempo de execução e os custos do processo. Assim, uma estratégia metodológica ideal deve ser capaz de aliar alta sensibilidade de detecção, especificidade compatível para repasto sanguíneo em múltiplas espécies animais, além de baixo custo. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou desenvolver uma nova abordagem de PCR em tempo real com SYBR Green baseada na amplificação das regiões do genoma mitocondrial (WMG-qPCR) que são menos conservadas entre humanos (Homo sapiens), caninos (Canis lupus familiaris), felinos (Felis catus), murinos (Rattus novergicus) e galináceos (Gallus gallus). Para tanto, na primeira etapa experimental, três protocolos de extração de DNA foram ajustados e adequados para que se obtivessse amostras de DNA mitocondrial (mtDNA) com rendimento e qualidade adequada para uso na WMG-qPCR. Na segunda etapa experimental, a especificidade das amplificações foi testada através de ensaio de reação-cruzada com o DNA das espécies animais. A sensibilidade das reações foi determinada por construção de curvas-padrão com concentrações de DNA equivalentes a 0,1 x 106 a 1 l de sangue extraído a partir de cada espécie animal. O DNA de flebotomíneos machos da espécie Lutzomyia longipalpis também foi utilizado nas reações para a exclusão de falsos positivos. Dentre os principais resultados destacaram-se o kit baseado em ligação de DNA total em resina de sílica que foi capaz de obter maior quantidade de mtDNA; a metodologia WMG-qPCR que apresentou alta sensibilidade e espécie-especificidade sendo capaz de promover a detecção de 26, 84, 130, e 320 fg DNA em 10 pL de sangue de felino, humano, canino e murino, respectivamente; além disso, foi capaz de amplificar 5pg de DNA em 5 pL de sangue de galináceo. Assim, a metodologia WMG-qPCR se apresentou como importante ferramenta para investigação de repasto sanguíneo, devido a sua capacidade de diferenciar possíveis fontes preferenciais de Lutzomyia spp.

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Study meal sandfly habit has great ecological and epidemiological significance. Different methods, including use of serological techniques were used to identify the sources of repast. However, moleculares approaches with high sensitivity and specificity have excelled as important tools in this area. Mitochondrial gene amplification strategies, such as cytochrome b, using conventional PCR or real time PCR have been used with high levels of detection. However, inadequate specificity of gene amplification approaches employed demand the joint use of ancillary techniques that contribute to increase the runtime and process costs. Thus, an ideal strategy methodology should be able to combine high detection sensitivity, specificity compatible for blood feeding in multiple species, and low cost. Thus, this research project aims to develop a new PCR approach in real time with SYBR Green based on amplification of regions of the mitochondrial genome (WMG-qPCR) that are less conserved between human (Homo sapiens), dogs (Canis lupus familiaris), cats (Felis catus), mice (Rattus norvegicus) and chickens (Gallus gallus). Therefore, the first experimental stage, three DNA extraction protocols will be adjusted and appropriate in order to obtain mitochondrial DNA samples (mtDNA) yield and quality suitable for use in WMG-qPCR. In the second experimental stage, the specificity of the amplifications will be tested through cross-reaction assay with the DNA of the animal species. The sensitivity of the reactions will be determined by construction of standard curves with DNA concentrations equivalent to from 0.0000001 to 1 ml of blood drawn from each animal species. The DNA of male sandflies of the Lutzomyia longipalpis species will also be used in the reactions to the exclusion of false positives. Among the most important results is emphasized that the kit based on the total DNA binding silica resin was able to achieve greater amount of mtDNA; WMG-qPCR methodology showed high sensitivity and species-specificity being capable of promoting the detection of 10 uL of blood, equivalent to 26, 84, 130, and 320 fg DNA feline, human, canine and murine respectively; Furthermore, he was able to amplify 5 gallinaceous blood pL (5 pg DNA). The WMG-qPCR methodology presented as an important tool for blood feeding research due to their ability to differentiate possible preferred sources of Lutzomyia spp.

Biblioteca responsável: BR68.1