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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203859

Resumo

Ao longo da vida reprodutiva dos machos adultos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonial stem cells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a preservação da linhagem germinativa, porém os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento, o que encarece a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. A literatura científica ainda não definiu uma metodologia que seja eficaz na congelação das SSCs, bem como na seleção de uma população pura, ou seja, sem contaminação por células que possam causar carcinomas. O presente estudo teve por objetivo avaliar duas metodologias de vitrificação de tecido testicular de murinos. Para testar esse objetivo, testículos de camundongos da linhagem C57BL6 GFP+ com 8 a 10 dias de idade foram submetidos a dois protocolos (Protocolo 1 e Protocolo 2) de vitrificação de tecido testicular descritos na literatura. Após 4 a 12 semanas, os testículos vitrificados foram aquecidos, reidratados e as células testiculares dissociadas para avaliação da viabilidade e concentração. As SSCs foram selecionadas por meio de separação celular por beads magnéticas (MACS) com anticorpo Thy1.2 e transplantadas para testículos de camundongos adultos da linhagem C57BL6 previamente tratados com o quimioterápico busulfan. Após seis semanas, os testículos destes animais foram coletados e os túbulos seminíferos dissociados para avaliação da formação de colônias pelas SSCs transplantadas. Houve diferença estatística (p<0,0001) na viabilidade das células entre o Protocolo 1 e Protocolo 2, sendo de 74,4% e 82,8%, respectivamente. Também houve diferença estatística (p<0,0001) na concentração de células obtidas entre o Protocolo 1 e Protocolo 2, sendo de 0,43x106 e 1,35x106, respectivamente. Colônias formadas pelas SSCs transplantadas foram encontradas nos testículos dos animais transplantadas para os dois protocolos de vitrificação. De forma descritiva, podemos relatar que o número de colônias observadas para as células do Protocolo 2 foi maior comparado ao Protocolo 1. Portanto, conclui-se que os protocolos de vitrificação de tecido testicular de camundongos estudados foram capazes de preservar a viabilidade de células-tronco espermatogoniais possibilitando a formação de colônias por estas, sendo que o Protocolo 2 de vitrificação foi mais eficiente.

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Throughout the reproductive life of adult males, spermatozoa are formed by spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for preservation of the germ line, but the protocols require the addition of growth factors, which increases the maintenance costs of these cells for a prolonged time, making of the SSCs cryopreservation an alternative for this problem. The scientific literature has not yet defined a methodology that is effective in the freezing of SSCs, as well as in the selection of a pure population, that is, without contamination by cells that involves the carcinomas. The present study aimed to evaluate two methodologies of vitrification of murine testicular tissue. To test this aim, testes of mice of the C57BL6 GFP + strain with 8 to 10 days old were submitted to two protocols (Protocol 1 and Protocol 2) of testicular tissue vitrification. After 4 to 12 weeks, the vitrified testes were warmed, rehydrated and the testicular cells dissociated for viability and concentration assessment. The SSCs were selected by magnetic-activated cell sorting (MACS) using Thy1.2 antibody and transplanted to testes of adult mice of the C57BL6 strain previously treated with the quimioterapic busulfan. After six weeks, the testes of these animals were collected and seminiferous tubules dissociated to evaluate the formation of colonies by transplanted SSCs. There was a statistical difference (p<0.0001) in cell viability between Protocol 1 and Protocol 2, being 74.4% and 82.8%, respectively. There was also a statistical difference (p<0.0001) in the concentration of cells obtained between Protocol 1 and Protocol 2, being 0.43x106 and 1.35x106, respectively. Colonies formed by the transplanted SSCs were found in the testes of the transplanted animals for the two vitrification protocols. In a descriptive way, we can report that the number of colonies observed for Protocol 2 cells was higher compared to the Protocol 1. Therefore, it is concluded that the mice testicular tissue vitrification protocols studied were able to preserve the viability of spermatogonial stem cells allowing the formation of colonies by these cells and the vitrification Protocol 2 was more efficient.

Biblioteca responsável: BR68.1