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DESENVOLVIMENTO DE TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA PARA DIAGNÓSTICO DA TRIPANOSOMÍASE BOVINA UTILIZANDO PROTEÍNA RECOMBINANTE DE Trypanosoma vivax UBERABA, MG 2016

GUILHERME CAETANO GARCIA.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-204058

Resumo

A tripanosomíase é causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma vivax e acomete ungulados domésticos e selvagens. Estima-se que animais infectados contribuam com uma perda anual de 160 milhões de dólares, devido a redução na produção de leite e carne, perda de escore corporal, dificuldades na reprodução, abortos e em muitos casos, morte. O patógeno causa sintomatologia clínica que pode ser similar a outras patologias que acometem bovinos, portanto o diagnóstico deve ser preciso e não erroneamente diagnosticado como uma doença com sintomatologia similar. O objetivo do presente trabalho foi obter proteína recombinante do Trypanosoma vivax e padronizar um teste ELISA (Enzime linked immunosorbent assay), para diagnóstico da tripanosomíase bovina com maior sensibilidade e especificidade. Uma proteína foi selecionada por meio de análise por bioinformática, produzida de forma recombinante, expressa, purificada e utilizada na padronização do ELISA. Inicialmente, diferentes concentrações de proteína recombinante (1, 10, 100 e 1000 nanogramas) foram testadas, bem como diferentes diluições de pool de soros positivos de animais experimentalmente infectados e negativos (1:100, 1:250 e 1:500) e diferentes diluições de conjugado anti-IgG marcado com peroxidase (1:5000, 1:10000 e 1:20000). Após a padronização, foi realizado o teste utilizando-se amostras de bovinos infectados experimentalmente por T. vivax nos dias 0, 21, 24, 27 e 30 pós-infecção experimental. A maior diferença de densidade ótica entre animais positivos e negativos foi observada utilizando-se 1000 nanogramas de proteína recombinante, soro na diluição de 1:100 e conjugado na diluição de 1:5000. Após analisar as densidades óticas, foi realizada a curva ROC (Receiver Operating Characteristic) e estabelecido um ponto de corte de 0,04. O teste apresentou acurácia de 98,6%, sensibilidade de 94,4% e especificidade de 100%. Valor preditivo positivo e valor preditivo negativo foram 100% e 93,3%, respectivamente. A razão de verossimilhança negativa e positiva foram de 0,06 e +, respectivamente. A padronização se mostrou adequada com a quantidade utilizada de proteína recombinante de 1000 nanogramas, diluição de soros de 1:100 e diluição de conjugado de 1:5000. Sensibilidade e especificidade obtidos com soro de animais infectados experimentalmente são promissores e destacam o potencial da proteína recombinante para diagnóstico preciso da tripanosomíase bovina.
Tripanosomiasis is caused by the hemoflagellate protozoan Trypanosoma vivax and affects domestic and wild ungulates. It is estimated that infected animals can contribute to an estimated annual loss of 160 million dollars, due to decrease in milk and meat production, loss of body condition, difficulties in reproduction, abortion, and in many cases death. The pathogen causes clinical symptoms that can be similar to other pathologies that affect bovines, therefore, the diagnosis must be precise and not misdiagnosed to a disease with similar symptoms. The objective of this present study was to obtain recombinant protein from Trypanosoma vivax and standardize an ELISA (Enzime linked immunosorbent assay), for the diagnosis of bovine tripanosomiasis with higher sensitivity and specificity. A protein was selected via bioinformatics analysis, recombinantly produced, expressed, purified and used in ELISA padronization. Initially, different concentrations of recombinant protein (1, 10, 100 and 1000 nanograms) were tested, as well as different dilutions of sera pool of positive animals experimentally infected and negative (1:100, 1:250 e 1:500), and different dilutions of conjugate anti-IgG marked with peroxidase (1:5000, 1:10000 and 1:20000). After padronization, the test was performed using samples from bovines experimentally infected with T. vivax on days 0, 21, 24, 27 and 30 after experimental infection. The highest difference of optical density among positive and negative animals was observed using 1000 nanograms of recombinant protein, sera dilution of 1:100 and conjugate dilution of 1:5000. After optical density analysis, a Receiver Operating Carachteristic (ROC) curve was done and a cut- off of 0,04 was stablished. The test showed accuracy of 98,6%, sensibility of 94,4% and specificity of 100%. Predicted positive and negative values were respectively 100% e 93,3%. Negative and positive likelihood ratio were respectively 0,06 e +. Standardization showed adequate with the used amount of recombinant protein of 1000 nanograms, sera dilution of 1:100 and conjugate dilution of 1:5000. Sensitivity and specificity results obtained using sera of experimentally infected animals were promising and show the potential of the recombinant protein for the precise diagnose of bovine tripanosomiasis.
Biblioteca responsável: BR68.1