AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES ANTIPROLIFERATIVAS DA LAPACHONA EM CULTURA DE CÉLULAS DE OSTEOSSARCOMA CANINO

RESUMO

O osteossarcoma é o tumor maligno das células ósseas primitivas mais diagnosticado em cães e humanos. A necessidade de medicamentos mais efetivos, com menor consequência adversa, tem gerado esforços para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos compostos por plantas e outras fontes naturais. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos intracelulares da lapachona sobre células do osteossarcoma canino de cultura estabelecida, bem como identificar mecanismos de ação que possam explicar suas propriedades antiproliferativas. Células de osteossarcoma canino foram obtidas do banco de linhagens celulares, subcultivadas e submetidas ao tratamento com a lapachona, de acordo com as diferentes concentrações. Os resultados foram obtidos por meio do método de exclusão do corante azul de tripan, pelo método de redução do tetrazólio, pelo ensaio de sobrevivência clonogênica, pelo ensaio de dupla marcação com Anexina V-FITC e Iodeto de Propídio, pelo ensaio de marcação com o corante JC-1 e pela análise da cinética do ciclo celular. O grupo tratado com 0,3 M de lapachona apresentou melhor regressão da viabilidade celular (80,27% / 24h; 47,41% / 48h e 35,19% / 72h) e maior progressão da citotoxicidade (19,73% / 24h; 52,59% / 48h e 64,81% / 72h). O menor IC 50 (0,180 M) ocorreu no grupo tratado por 72 horas. O crescimento celular após o tratamento foi menor de acordo com o aumento da concentração e tempo de exposição, apresentando 0,50% de fração de sobrevivência na concentração de 1,0 µM. Não houve diferença estatística entre as concentrações, para a proliferação celular após o tempo de exposição à lapachona. A apoptose inicial foi o tipo de morte celular mais frequente em todos os grupos. Foi menor no grupo de 24 horas tratado com 0,1 M (4,26 %) e maior no grupo de 72 horas tratado com 1,0 M (85,89 %). A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira dose dependente, caracterizando a apoptose intrínseca. A inibição do crescimento das células ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 conforme o tempo de exposição. A lapachona possui efeitos antiproliferativos, citotóxicos, induz apoptose intrínseca e promove o bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1, nas células de osteossarcoma canino.

ABSTRACT

Osteosarcoma is the most diagnosed primary bone cell tumor in dogs and humans. The need for more effective drugs with less intense collateral effect has triggered the development of plant-derived, natural-source chemotherapeutics. This study aimed to verify lapachone intracellular effects on canine osteosarcoma cultured cells, as well as identify action mechanisms related to its antiproliferative properties. Cells were obtained from a cell line bank, sub cultivated and subjected to treatment with different lapachone concentrations, followed by tetrazolium reduction, Tripan Blue dye exclusion assay, clongenic survival assay, Annexin V-FITC and propidium iodine double-labeling, JC-1 dye labeling and cell cycle kinetics analysis. The group treated with lapachone for 72 hours showed the slightest cell viability, 27,74%, and the most conspicuous citotoxic effect, 64,81%, at 0,3 M concentration; littlest IC50, 0,180 M and also the faintest cell growth - 0,50%- following treatment with 1,0 M concentration. No statistical difference for cell proliferation was verified between concentrations after lapachone exposure. Early apoptosis was the most frequent type of cell death considering all groups. It was less frequent in the 24-hour group treated with 0,1 M (4,26 %) and more frequent in the 72-hour group treated with 1,0 M (85,89 %). Mitochondrial depolarization was dose-dependent. Cell growth inhibition was carried out through cycle block at G0/G1 phase, according to exposure time. lapachone was shown to have antiproliferative and cytotoxic effects, to induce apoptosis and to block cell cycle at G0/G1 phase on canine osteosarcoma cells.