Caracterização molecular de ovócitos suínos de animais pré-púberes e púberes durante a maturação in vitro

RESUMO

Ovócitos de folículos antrais são dependentes de uma adequada regulação da expressão gênica para iniciar e completar seu processo de maturação. A maturação in vitro (MIV) é uma parte essencial da produção in vitro de embriões (PIVE). A qualidade dos ovócitos tem um papel essencial na produção e qualidade dos embriões resultantes, e a maturidade sexual da doadora é um fator que influencia as taxas de maturação. Este estudo teve como objetivo caracterizar o perfil de expressão de genes relacionados a apoptose, metabolismo lipídico e metilação do DNA e o perfil lipídico de ovócitos suínos de animais pré-púberes e púberes durante a maturação in vitro. Levando-se em consideração a maturidade sexual das fêmeas doadoras de ovócitos, as fêmeas púberes apresentaram melhores resultados tanto na recuperação como na maturação dos ovócitos (p<0,001, para ambas as analises). A quantidade de RNAm para o gene BAX foi diferente entre ovócitos imaturos e maturos in vitro de porcas, mostrando menor abundância relativa em imaturos (P = 0,09). Entre os genes relacionados ao metabolismo lipídico, o gene SLC27A4 apresentou menor abundância relativa de RNAm em ovócitos imaturos comparados com os maturos in vitro em porcas (P = 0,05). Os genes CPT2 e PLIN2 apresentaram níveis de RNAm mais baixos em ovócitos imaturos em comparação com ovócitos maturos in vitro em marrãs (P = 0,05; P = 0,02). Em relação aos genes relacionados à reprogramação da metilação do DNA, os genes DNMT3A eTET3 apresentaram níveis de RNAm mais baixos em ovócitos imaturos em relação aos maturos in vitro em marrãs (P = 0,02; P = 0,0005). Além disso, a expressão de TET3 também foi diferente nos ovócitos de porcas, mostrando níveis mais baixos nos ovócitos imaturos (P = 0,02). Diferente de todos outros genes, TET1 apresentou maior abundância relativa de RNAm em ovócitos imaturos em comparação com os ovócitos maturos in vitro em porcas (P = 0,05). Em relação ao perfil lipídico, houve uma aproximação dos perfis moleculares entre os ovócitos maturos de porcas e marrãs após o processo de maturação, com um agrupamento de lipídeos com massa superior a 700m/z que compõem uma faixa de fosfolipídios complexos. Com base em nossos resultados, podemos concluir que o armazenamento de RNAm materno (herança materna), importante para a ovogênese e para o desenvolvimento inicial do embrião, assim como uma reorganização da composição lipídica do ovócito, só são totalmente estabelecidos durante o final da ovogênese, dentro do processo de maturação do ovócito. Esse trabalho mostrou que mesmo ao final da ovogênese, com o ovócito totalmente crescido e dentro de um processo de divisão meiótica, ainda há eventos de transcrição gênica e tradução e uma grande reorganização de perfis lipídicos. Assim, é importante estudar os possíveis efeitos de diferentes sistemas de maturação in vitro sobre o estabelecimento final dos estoques maternos de RNAm e de lipídeos, essenciais ao correto desenvolvimento embrionário posterior. Finalmente, os genes que foram diferencialmente expressos durante a maturação in vitro, bem como o perfil lipídico dos ovócitos maturados, são potenciais candidatos para serem utilizados como marcadores moleculares para qualidade de ovócitos, subsidiando o desenvolvimento e adaptação de novos protocolos de maturação in vitro em mamíferos.

ABSTRACT

Oocytes from antral follicles are dependent on adequate gene expression regulation to initiate and to undergo oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) is an essential part of the in vitro embryo production (IVP). The quality of oocytes plays an important role in determining the production and quality of the resulting embryos, and the sexual maturity of the donor is a factor that influences the maturation rate. This study aimed to characterize the expression profile of genes related to apoptosis, lipid metabolism and DNA methylation and the lipid profile in pig oocytes during in vitro maturation. Oocytes from gilts and sows were obtained from abattoirs and were matured in vitro. Regarding sexual maturity of females donors, oocytes from pubertal females showed better results both in recovery and maturation of oocytes (p<0.001 for both analyses. Considering the sexual maturity, comparing gene expression during in vitro maturation, the quantity of BAX mRNA was different between immature and in vitro matured oocytes from sows, showing lower relative abundance in immature ones (P=0.09). Among genes related to lipid metabolism, SLC27A4 showed lower relative abundance in immature compared to in vitro matured oocytes from sows (p = 0.05). CPT2 and PLIN2 genes showed lower levels in immature compared to in vitro matured oocytes from gilts (P=0.05;P=0.02). Regarding genes related to DNA methylation reprogramming, DNMT3A and TET3 showed lower levels in immature than in in vitro matured oocytes from gilts (P=0.02; P=0.0005); moreover, TET3 was different in oocytes from sows, showing lower levels in immature than in in vitro matured (P=0.02). Different of all other genes, TET1 showed higher relative abundance in immature oocytes compared to in vitro matured oocytes from sows (P=0.05). It was also observed, in relation to lipid profile, that there was an alignment between the mature oocyte of sows and gilts after the maturation process, with a group of lipids with mass greater than 700m/z, which comprise a range of complex phospholipids. Based on our results, we can conclude that the maternal mRNA storage, important to oogenesis and initial embryo development, is only totally established during the oocyte maturation. This work showed that even at the and of oogenesis, with fully grown oocyte within meiosis process, there is still gene transcription and translation events and a major lipid profiles reorganization. Thus, is important study the possible effects of different in vitro maturation systems in the final establishment of maternal mRNA and lipids stocks, which are essential to the correct subsequent embryonic development. Finally, the genes the genes were differentially expressed during in vitro maturation and the lipid profile of the maturated oocytes are potential candidates for use as molecular markers for oocyte quality, supporting the development and adaptation of new in vitro maturation protocols for mammals.