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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-204483

Resumo

Alguns estudos têm mostrado que crioinjúrias observadas durante a vitrificação levam à perda da integridade de proteínas membranárias que constituem as comunicações intercelulares. Dentre as proteínas de membranas que formam essas comunicações, destacam-se as conexinas 37 (Cx37) e 43 (Cx43), as quais são importantes na interação entre oócito e células foliculares. Este estudo teve como principal objetivo avaliar o efeito da vitrificação do tecido ovariano ovino utilizando o ovarian tissue cryosystem (OTC), associado ao cultivo in vitro de folículos secundários isolados, sobre o padrão de expressão gênica e protéica das Cx37 e Cx43. Para isso, seis diferentes tratamentos foram avaliados: 1) tecido ovariano fresco (FOT); 2) tecido ovariano vitrificado (VOT); 3) folículos secundários frescos isolados de tecido ovariano fresco (FIF); 4) folículos secundários cultivados in vitro, isolados do tecido ovariano fresco (CIF); 5) folículos secundários isolados do tecido ovariano vitrificado (VIF) e 6) folículos secundários cultivados in vitro, isolados de tecido ovariano vitrificado (CVIF). O tecido ovariano fresco ou vitrificado, bem como os folículos isolados de todos os tratamentos foram avaliados quanto à expressão gênica e protéica para as Cx37 e Cx43. Adicionalmente, folículos secundários foram analisados para a integridade e crescimento folicular, morte por apoptose e proliferação celular, e folículos secundários somente cultivados in vitro (CIF e CVIF) foram avaliados para morfologia (folículos extrusos), formação de antro e viabilidade. O percentual de folículos intactos no tratamento CVIF foi significativamente superior (P < 0,05), enquanto que a formação de antro, taxa de extrusão e viabilidade folicular foram inferiores (P < 0,05) aos folículos do tratamento CIF. O teste TUNEL mostrou que folículos frescos (FIF) não apresentaram apoptose, enquanto os folículos nos demais tratamentos (CIF, VIF e CVIF) mostraram marcação positiva. A proliferação celular nos tratamentos VIF e CVIF foi mais intensa do que nos folículos do FIF. Em relação à expressão gênica, nos folículos secundários apenas a Cx43 apresentou alterações nos níveis de expressão de mRNA, sendo que os folículos do tratamento CVIF apresentaram níveis de RNAm significativamente inferiores, comparados aos folículos dos demais tratamentos. A Cx37 e Cx43 foram predominantemente imunolocalizadas nas células da granulosa e oócitos, respectivamente. Em conclusão, folículos secundários ovinos podem ser isolados com sucesso após a vitrificação do tecido ovariano e são capazes de manter a integridade da membrana após o cultivo in vitro. Embora a expressão gênica e protéica da Cx37 não varie após a vitrificação do tecido ovariano, a Cx43 é alterada nos folículos secundários após vitrificação e cultivo in vitro.

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Previous studies have demonstrated that cryoinjuries showed through vitrification leads to a loss of integrity of membrane proteins that constitutes the intercellular communications. Among these membrane proteins, it is prominent the role of connexins 37 (Cx 37) and 43 (Cx 43). Thus, this study aimed evaluate the effect of vitrification of ovine ovarian tissue using ovarian tissue cryosystem (OTC), associated to in vitro culture of isolated secondary follicles, under genetic and protein expression pattern of Cx 37 and Cx 43. Ovarian fragments were distributed into six different treatments: 1) fresh ovarian tissue (FOT); 2) vitrified ovarian tissue (VOT); 3) isolated secondary follicles of fresh ovarian tissue (FIF); 4) secondary follicles cultured in vitro, follow by isolation of ovarian tissue (CIF); 5) isolated secondary follicles of vitrified ovarian tissue (VIF) and 6) secondary follicles cultured in vitro, and then isolated of vitrified ovarian tissue (CVIF). Fresh or vitrified ovarian tissue as well as isolated follicles of all treatments were evaluated to genetic and protein expression for Cx 37 and Cx 43. Additionally, secondary follicles were analyzed to integrity, follicular growth, apoptosis, and cell proliferation, while only cultured secondary follicles (CIF and CVIF) were evaluated by morphology (extruded follicles), antrum formation and viability. The percentage of intact follicles on CVIF treatment had higher (P < 0.05) while antrum formation, extruded rate and follicle viability were lower (P < 0.05) to follicles on treatment CIF. TUNEL assay demonstrates that in fresh follicles (FIF) did not show apoptosis, while follicles from other treatments had a positive labelling. A cell proliferation on VIF and CVIF treatments had more intensity of follicles from FIF. In relation to genetic expression on secondary follicles, only Cx43 alters mRNA levels, and follicles of CVIF treatment had lower (P < 0.05) mRNA levels when compared to follicles of other treatments. Cx37 and Cx43 had an immunolabelling mainly on granulosa cells and oocytes, respectively. In conclusion, the isolation of ovine secondary follicles occurs successfully after vitrification of ovarian tissue and be able to maintain the integrity of membrane after in vitro culture. Although the genetic and protein expression of Cx37 did not varies after vitrification of ovarian tissue, Cx 43 is altered on secondary follicles after vitrification and in vitro culture. Keywords:

Biblioteca responsável: BR68.1