ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DA MICROBIOTA ESPORULADA E FÚNGICA ASSOCIADA À DETERIORAÇÃO DO LEITE

RESUMO

A produção de leite vem aumentado no estado do Paraná e no Brasil, porém, a sua qualidade ainda é um problema. A baixa qualidade do leite cru refrigerado brasileiro faz com que a vida útil do leite pasteurizado não alcance seis dias. O aumento da vida útil do leite pasteurizado está diretamente relacionado à redução das contagens de micro-organismos deteriorantes proteolíticos e lipolíticos, sobretudo os termodúricos e esporulados no leite cru, que constituirão a microbiota remanescente no leite pasteurizado. Não há dados no Brasil sobre a composição da microbiota esporulada e fúngica termodúrica presente no leite, dificultando o seu controle. O presente trabalho teve por objetivo identificar os micro-organismos formadores de esporos e a microbiota fúngica do leite cru refrigerado com atividade proteolítica e/ou lipolítica por técnicas moleculares. Foram avaliadas 20 amostras de leite cru refrigerado produzido na bacia leiteira de Castro, região central do estado do Paraná, nas quais foram realizadas a contagem de esporos aeróbios, verificação da atividade proteolítica e lipolítica dos isolados, amplificação parcial do gene 16S rRNA, sequenciamento e identificação por similaridade usando a ferramenta BLAST para comparação com as sequencias depositadas no GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Para o isolamento dos fungos, as amostras de leite cru foram submetidas à pasteurização laboratorial, semeadas e incubadas em temperaturas apropriadas para a multiplicação de bolores e leveduras termodúricos mesófilos e psicrotróficos. Também foi avaliado o potencial proteolítico dos isolados obtidos, que foram identificados por microscopia óptica e confirmados por sequenciamento da região ITS do DNA. As contagens de esporos aeróbios variaram de 1 a 3,7 log UFC.mL-1, com média de 1,75 (±0,59) log UFC.mL-1. Foram obtidos 137 isolados puros de bactérias a partir da germinação dos esporos, dos quais 40 (29,2%) apresentaram atividade deteriorante do leite. Dessas, 31 (77,5%) foram proteolíticas e lipolíticas, 7 (17,5%) foram exclusivamente lipolíticas e 2 (5%) foram apenas proteolíticas. As 40 cepas de esporos aeróbios proteolíticos e/ou lipolíticos submetidas ao sequenciamento do 16S rRNA, foram identificadas como Bacillus licheniformis (55%), Bacillus sp. (27,5%), Paenibacillus sp. (7,5%), Bacillus pumilus (5%), Bacillus circulans (2,5%) e Brevibacillus sp. (2,5%). Estudos anteriores sobre a composição da microbiota do leite cru refrigerado brasileiro não relatam a presença de micro-organismos do gênero Paenibacillus, apesar de ser um grupo de micro-organismos frequentemente descrito nos trabalhos desenvolvidos em outros países. Dos 22 isolados de B. licheniformis, 21 (95,5%) apresentaram atividade proteolítica e lipolítica e 1 (4,5%) foi apenas proteolítico. As duas cepas de B. pumilus foram proteolíticas e lipolíticas, enquanto a cepa de B. circulans foi apenas lipolítica. Em relação aos 11 isolados de Bacillus sp., oito (72,7%) foram proteolíticos e lipolíticos, um (9,1%) foi proteolítico e outros dois (18,2%) lipolíticos. Os três isolados de Paenibacillus sp. foram apenas lipolíticos, assim como a cepa de Brevibacillus sp. Com relação aos fungos, foram obtidos 11 isolados, um mesófilo e outros 10 psicrotróficos. Todos os isolados foram proteolíticos. O sequenciamento do DNA fúngico amplificado confirmou a identificação microscópica, sendo a cepa termodúrica mesófila identificada como espécies do complexo Fusarium chlamydosporum (9,09%), e os psicrotróficos como Cladosporium cladosporoides (54,54%), Curvularia geniculatus (9,09%) e os outros 3 isolados foram identificados como Geotrichum candidum (27,27%). A presença de fungos termodúricos mesófilos e psicrotróficos proteolíticos no leite cru pode resultar em redução da vida útil do leite pasteurizado, bem como em risco à saúde pela presença de cepas patogências e produtoras de micotoxinas. A redução dos micro-organismos termodúricos, proteolíticos e/ou lipolíticos no leite cru, diminui a quantidade de micro-organismos e enzimas deteriorantes termoestáveis no leite pasteurizado, aumentando sua vida útil.

ABSTRACT

Milk production has increased in the Paraná state and Brazil, but its quality is still a important problem. The low quality of brazilian refrigerated raw milk makes the shef-life of pasteurized milk not reach 6 days. Increased shelf-life of pasteurized milk is directly related to the reduction of microorganisms counts proteolytic and lipolytic rough, especially thermoduric and spores in raw milk, which constitute the remaining microbiota in pasteurized milk. There is no data in Brazil about the composition of the spore-forming and thermoduric fungal microbiota in milk, hindering the control. The aim this study was to identify the microorganisms spore-forming and mycoflora of refrigerated raw milk with proteolytic and/or lipolytic activity by molecular biological techniques. Were evaluated 20 samples of refrigerated raw milk produced in the dairy region Castro, Paraná, Brazil, in which were performed aerobic spore count, verification of proteolytic and lipolytic activity of the isolated, partial amplification of the 16S rRNA gene, identification by sequencing data and comparison with the sequences deposited in GenBank of National Center for Biotechnology Information (NCBI). For the isolation of thermoduric fungi, the raw milk samples were subjected to laboratory pasteurization, plated and incubated at appropriate temperatures for multiplication of molds and yeasts mesophilic and psychrotrophic. We also assessed the proteolytic potential of these isolates that were identified by optical microscopy and confirmed by sequencing data the ITS region of DNA. Aerobic spore counts ranged from 1 to 3.7 log CFU.mL-1, with a mean of 1.75 (± 0.59) log CFU.mL-1. One hundred thirty-seven bacterial isolates were obtained from germination of spores, of which 40 (29.2%) showed deteriorating activity of milk. Of these, 31 (77.5%) were proteolytic and lipolytic, 7 (17.5%) were exclusively lipolytic and 2 (5%) were only proteolytic. The 40 strains of aerobic spore-forming proteolytic and/or lipolytic sequecing to 16S rRNA were identified as Bacillus licheniformis (55%), Bacillus sp. (27.5%), Paenibacillus sp. (7.5%), Bacillus pumilus (5%), Bacillus circulans (2.5%) and Brevibacillus sp. (2.5%). Previous studies about the microbiota of brazilian refrigerated raw milk not report the presence of Paenibacillus genus, although a group of microrganisms frequently described the work undertaken in other countries. Of the 22 isolates of B. licheniformis, 21 (95.5%) showed proteolytic and lipolytic and 1 (4.5%) was only proteolytic. The 2 strains of B. pumilus are proteolytic and lipolytic while the strain of B. circulans was only lipolytic. Of the 11 isolates of Bacillus sp., 8 (72.7%) were proteolytic and lipolytic, 1 (9.1%) was proteolitic and other 2 (18.2%) were lipolytic only. The 3 isolates of Paenibacillus sp. were just lipolytic as well as the strain of Brevibacillus sp.. For fungi were obtained 11 strains, 1 mesophilic and 10 psychrotrophic. All isolates were proteolytic. The sequencing data of the amplified DNA confirmed fungal microscopic identification, and the strain identified as thermoduric mesophilic species complex Fusarium chlamydosporum (9.09%) and the psychrotrophic as Cladosporium cladosporoides (54.54%), Curvularia geniculatus (9.09%) and the other 3 isolates were identified as Geotrichum candidum (27.27%). The presence of mesophilic and psychrotrophic thermoduric proteolytic fungi in raw milk may result in shortening the shelf-life of pasteurized milk, as well as health risk by the presence of patogenic strains and mycotoxin production. The reduction of microorganisms thermoduric, proteolytic and/or lipolytic on raw milk decreases the amount of spoilage microorganisms and thermostable enzymes in pasteurized milk, increasing its shelf-life.