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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-204733

Resumo

Contaminações bacterianas em níveis acima de 107bactérias/mL são comumente encontrados na produção de etanol podendo ocasionar queda na viabilidade da Saccharomyces cerevisiae, podendo gerar perdas diárias de até 30 mil litros de etanol em uma usina de médio porte brasileira. Atualmente, antibióticos são adicionados para reduzir esse problema; porém, muitas dessas bactérias se encontram na forma de biofilmes, que conferem alta resistência à esses micro-organismos. Esses biofilmes são uma fonte crônica de contaminação da dorna de fermentação etanólica em muitas usinas. Além disso, antibióticos deixam resíduos em subprodutos comercializáveis, como o extrato de levedura que é utilizado na alimentação animal.A comunidade europeia proibiu o uso de antibióticos na alimentação animal, e o Brasil já sofreu embargos ao exportar extrato de levedura contendo traços de monensina sódica.Assim, existe uma demanda da indústria por compostos antimicrobianos capazes de reduzir a população contaminante no processo fermentativo e que não tenha restrição de utilização por países importadores de levedura.Perante esse problema,o uso de alternativas naturais e seguras para uso nas usinas sucroalcooleiras vem sendo sugerido. Porém, estudos sobre antimicrobianos contra biofilmes na produção de etanol são escassos. Assim, objetivou-se neste estudo averiguar a eficácia dos antimicrobianos naturais carvacrol, nisina e extrato de lúpulo combinado ao surfactante dodecil sulfato de sódio (DSS) como bactericidas e removedor da biomassa de biofilmes formados por Lactobacillusfermentum (LF), Lactobacillus plantarum (LP), Leuconostocmesenteroides (LM) e acombinação(pool)delas. Essas bactérias sãocomumente associadas a contaminações em usinas brasileiras. Para isso, foram testadas doses in vitro de carvacrol, nisina, extrato de lúpulo e o surfactante DSS isolados contra células planctônicas para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de cada composto. Além disso, cada antimicrobiano natural foi associado com o DSS para determinação de CIM e posteriormente contra biofilmes pré-formados por essas bactérias. Os testes em biofilme avaliaram o efeito dasfórmulas antimicrobianas para a remoção de biomassa de biofilme (método do cristal violeta - CV) e na inibição da atividade metabólica (inibição da redução de metil tiazol tetrazólio - MTT). Esses testes foram realizados em microplacas de poliestireno e método de MTT também foi empregado no sistema do reator de biofilme incorporado em papel (Paper embedded biofilm reactor PEBR). Também foram preparadas amostras com e sem tratamento antimicrobiano para visualização em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Através dos testesiniciaisobservou-se um valor de CIM para o carvacrol de 250 mg/L, lúpulo 5 mg/L, nisina Z 30 mg/L e DSS 37,5 mg/L. Foi afirmada a existência de efeito sinérgico entre os compostos carvacrol+DSS (ICIF 0,124) e nisina+DSS (ICIF 0,240) e uma interação insignificativa entre lúpulo+DSS (ICIF 1), contra as três bactérias e seu crescimento combinado (pool). Foi possível observar nos testes de MTT e CV que a porcentagem de inibição de atividade metabólica de todos os compostos contra as bactérias foi maior que a porcentagem de remoção de massa de biofilme. Para o sistema PEBR observou-se uma menor porcentagem de inibição, que provavelmente ocorreu pela maior aderência do biofilme em papel. As imagens obtidas no MEV tornam possível visualizar efeitos dos antimicrobianos no biofilme. Assim, pode-se observar o potencial do uso combinado dos antimicrobianos naturais e do surfactante DSS como auxiliares na limpeza de tanques e tubulações nas usinas, além de poderem ser usados como agentes profiláticos contra formação de novos biofilmes. O carvacrol+DSS apresentam os melhores resultados na placa de poliestireno e essa formulação possui o menor custo entre as fórmulas testadas neste estudo.

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Bacterial contamination in more than 107 bacteria/mL levels are commonly found in ethanol production leading to decreased viability of Saccharomyces cerevisiae, which may cause daily losses of up to 30,000 liters of ethanol in a medium-sized Brazilian plant. Currently, antibiotics are added to reduce this problem. However, many of these bacteria are in the form of biofilms, which confers high resistance to these microorganisms. These biofilms are a chronic source of contamination of ethanol fermentation tanks in many plants. In addition, antibiotics leave residues in tradable byproducts, such as yeast extract that is used in animal feed. The European Community banned the use of antibiotics in animal feed, and Brazil has suffered embargoes after exporting yeast extract containing traces of monensin. Thus, there is an industry demand for antimicrobial compounds able to reduce the contaminant population in the fermentation process and does not have use restriction for yeast importing countries. Faced with this problem, using natural and safe alternatives for use in sugarcane mills has been suggested. However, studies on antibiotics against biofilms in ethanol production are scarce. Thus, the objective of this study was to determine the efficacy of natural antimicrobials carvacrol, nisin and hop extract combined with the surfactant dodecyl sulfate sodium(SDS) to remove biofilms producec by Lactobacillus fermentum (LF), Lactobacillus plantarum (LP), Leuconostoc mesenteroides (LM) and their combination (pool). These bacteria are commonly associated with contamination in Brazilian plants. Therefore, carvacrol, nisin, hop extract and SDSwere testedin vitro against planktonic cellsto determine the minimum inhibitory concentration (MIC) for each compound. Furthermore, each natural antimicrobial was associated with SDS for determination of their MIC in combination and subsequently against pre-formed biofilm by the bacteria. The tests evaluated the effect of the antimicrobial formulations to remove biofilm biomass (crystal violet method - CV) and inhibit metabolic activity in the biofilm (methyl thiazol tetrazolium bromide MTT method). These tests were carried out on polystyrene microplates and MTT method was also employed in the biofilm reactor system embedded in the paper (Paper embedded biofilm reactor - PEBR). Samples were also prepared with and without antimicrobial treatment for observation on a scanning electron microscope (SEM). MIC values for carvacrol, hop extract, nisin Z and SDS were 250, 5, 30 and 37,5 mg/L, respectively. It was also shown the existence of synergism between carvacrol +SDS (ICIF = 0.124) and nisin + SDS (ICIF = 0.240), and an insignificant interaction between hop extract + SDS (ICIF = 1). The percentage of metabolic activity inhibition of all compounds was higher than the percentage of mass removal. For the PEBR system there was a smaller percentage of inhibition, which probably occurred by the greater adherence of the biofilm on paper. The SEM images demonstrate the antimicrobial effects on the biofilms. Thus, there is a potential for the combined use of natural antimicrobials and SDS to clean fermentation tanks and pipes of bioethanol plants, and they can be used as prophylactic agents against formation of biofilms. Carvacrol + SDSshowed the best results in the polystyrene plate and this formulation has the lowest cost among the formulations tested in this study.

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