Portal de Pesquisa da BVS Veterinária

Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-205427

Resumo

Clostridium perfringens é um bacilo Gram-positivo, formador de esporo e produtor de ao menos 17 toxinas, das quais, quatro são consideradas principais, a toxina alfa (CPA), beta (CPB), épsilon (ETX) e iota (CPI) utilizadas para classificar a espécie em cinco toxinotipos (A, B, C, D e E). A toxinfecção nos animais ocorre por via iatrogênica/traumática ou gastrointestinal. As principais enfermidades causadas por C. perfringens são gangrena gasosa, enterotoxemias, enterite necrótica/hemorrágica e enterocolite. As vacinas contra as toxinas de C. perfringens são extensivamente utilizadas em medicina veterinária, tornando-se a principal medida de controle e profilaxia nos rebanhos. Tem crescido o número de estudos visando à utilização de vacinas recombinantes contra as principais toxinas de C. perfringens (CPA, CPB e ETX). Com isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar os títulos de anticorpos neutralizantes antitoxinas CPA, CPB e ETX em coelhos vacinados com células inteiras inativadas de Escherichia coli (bacterinas recombinantes), assim como, a fração celular solúvel ou insolúvel, contendo tais antígenos. Após a expressão das proteínas, as células foram inativadas com formaldeído na concentração final 0,2% (v/v). Em seguida, a eficiência da inativação foi avaliada por plaqueamento de uma alíquota do cultivo em placas de LB ágar. Confirmada a inativação, as bactérias foram centrifugadas e lavadas com PBS estéril para remoção de formaldeído residual. Nas vacinas compostas por frações celulares solúveis e insolúveis, a presença dos antígenos rCPA, rCPB e rETX foi confirmada através de SDS-PAGE e western blot. As proteínas, nas duas formulações, foram quantificadas por SDSPAGE juntamente com uma curva com diferentes concentrações de albumina sérica bovina (BSA) e analisadas no software TotalLab quant®. As características de solubilidade dos antígenos recombinantes foram idênticas em ambos os vetores utilizados, pAE e pET28a, onde rCPA e rCPB foram expressas em corpos de inclusão e rETX na forma solúvel. Não foram detectados títulos de anticorpos neutralizantes antitoxinas CPA, CPB ou ETX no soro dos animais vacinados com ambas as formulações vacinais contendo 50 µg de cada antígeno expresso no vetor pAE. Entretanto, no segundo experimento com 200 µg de cada antígeno expresso em vetor pET28a, em ambas as formulações, geraram títulos de anticorpos neutralizantes antitoxina ETX de 10 UI/mL-1 , cinco vezes superior ao valor mínimo preconizado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Não foram detectados títulos de anticorpos neutralizantes antitoxina CPB. A titulação de anticorpos neutralizantes antitoxina CPA não foi realizada. Os resultados do presente estudo, não apenas sustentam a potencial utilização de antígenos recombinantes, mas também fornecem dados adicionais quanto à vacinação com células inteiras inativadas de E. coli ou fração celular solúvel e insolúvel contendo proteínas recombinantes. Essa forma alternativa de produção de vacinas recombinantes visa à disponibilização de antígenos de alta qualidade e baixo custo para utilização pela indústria veterinária

---

Clostridium perfringens is a spore-forming, Gram-positive bacillus that produces at least 17 alpha (CPA), beta (CPB), epsilon (ETX), and iota (CPI) toxins are used to classify this bacterium into five toxinotypes (A, B, C, D, and E). Animal toxinfection occurs via either the iatrogenic/traumatic or the gastrointestinal route. The main illnesses caused by C. perfringens are gas gangrene, enterotoxemias, haemorrhagic/necrotic enteritis and enterocolitis. Vaccines against C. perfringens toxins are largely used in veterinary medicine, rendering them the main prophylactic control measure in farm animals. The number of studies aiming to develop recombinant vaccines against C. perfringens alpha, beta, and epsilon toxins is on the rise. Studies looking for alternatives to diminish time and production costs are also gaining ground. Therefore, the present study aims to evaluate neutralizing antibody titers against CPA, CPB, and ETX in rabbits immunized with whole, inactivated de E. coli cells (recombinant bacterins) and with post-lysis cell fractions containing such antigens. After protein expression, E. coli cells were inactivated with formaldehyde 0,2% (v/v). Inactivation efficiency was assessed by plating sterile LB agar plates. Once inactivation was confirmed, bacteria were washed with sterile PBS to remove residual formaldehyde. The presence of rCPA, rCPB and rETX in vaccines comprised by both soluble and insoluble cell fractions was confirmed by means of SDS-PAGE and western blot. Proteins in both formulations were quantified by SDSPAGE using different BSA concentrations using TotalLab quant® software. Solubility characteristic were identical in both pAE and pET28a expression vectors: rCPA and rCPB were expressed in inclusion bodies and rETX was soluble. No neutralizing antibody titers against CPA, CPB or ETX were detected in the sera of animals immunized with either formulation containing 50 µg of each antigen when pAE was used. However, when pET28a was used, 200 µg of each antigen in either formulation were able to generate up to 10 UI/mL-1 of anti ETX neutralizing antibodies, which is five-fold the minimum required by the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply. Neutralizing antibodies against CPB were not detected. A toxoid-based commercial vaccine induced 10-20 UI/mL-1of neutralizing antibodies against CPB. Anti-CPA neutralizing antibodies titration was not performed. These results, not only support the use of recombinant antigens, but also provide data about immunization using whole, inactivated E. coli cells or both their soluble and not soluble fractions containing recombinant antigens as vaccines. This alternative recombinant vaccine production method yields high quality antigens with low production costs to be used in veterinary medicine.

Biblioteca responsável: BR68.1