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REPROGRAMAÇÃO DE FIBROBLASTOS DE PELE E CÉLULAS DO CORDÃO UMBILICAL POR MEIO DE PLASMÍDEOS VIRAIS E TRANSPOSONS NA PRODUÇÃO DE IPS EQUINAS

MIDYAN DAROZ GUASTALI.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-205491

Resumo

As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco aborda um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é preciso rever conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de plasmídeos virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, ou seja, fragmentos de DNAs que podem ser introduzidos nas células para efetuar a reprogramação, eliminando assim a partícula viral indesejada. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem multipotentes podem melhorar a eficiência da obtenção de iPS em comparação ao uso de fibroblastos, pouco eficientes ao serem reprogramados. O objetivo deste trabalho foi obter iPS por meio de transfecção viral e não-viral de fibroblastos adultos e células do cordão umbilical equino, visando observar qual o tipo de transfecção e qual o tipo de célula são mais eficientes para reprogramação celular. Para ambos os tipos celulares utilizamos plasmídeos virais e transposons contendo os genes OCT-4, C-MYC, KLF-4 e SOX2; acompanhamos as modificações na morfologia das células equinas pós-transfecção; avaliamos as células modificadas por imunocitoquímica e citometria de fluxo com os marcadores típicos de células-tronco pluripotentes e avaliamos as alterações causadas no perfil de expressão gênica das células pelo método de PCR em tempo real; por fim induzimos células reprogramadas a se diferenciar em tecidos dos3folhetos germinativos. Os resultados demostraram que tanto os fibroblastos quanto as células do cordão umbilical submetidos à transfecção viral apresentaram características de células pluripotentes como morfologia característica, marcação positiva para fatores de pluripotência e expressão gênica específica. Os corpos embrióides formados também apresentaram marcação imunocitoquimica para ectoderme, mesoderme e endoderme. Apesar do tempo para inicio da formação das colônias serem bem parecidos (7dias para os fibroblastos e 6 dias para as células do cordão umbilical), a expansão das colônias dos fibroblastos reprogramados foi bem lenta, com a 1ª passagem sendo realizada 30 dias após a transfecção em comparação comas colônias de cordão umbilical, nas quais a 1ª passagem foi realizada após 15 dias. Nos cultivos de fibroblastos reprogramados foram contadas 81 colônias e nos cultivos das células do cordão umbilical reprogramados foram contadas 90 colônias indicando que a eficiência de reprogramação é maior em células do cordão. Os transposons foram transfectados nos dois tipos celulares, mas não foi verificada reprogramação efetiva em nenhum deles. Conclui-se que o uso de plasmídeo viral na reprogramação de células de cordão umbilical é mais eficiente do que em fibroblastos e o uso de transposons foi inviável em ambos os cultivos.
Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to review basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNA fragments can be introduced into cells to perform reprogramming, eliminating thus unwanted viral particle. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the iPS compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and non-viral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. For both cell types used viral plasmids and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, C-MYC, and KLF-4; changes in the morphology of equine cells post-transfection have been observed; modifications in cell by immunocytochemistry and flow cytometry with the typical markers of pluripotent stem cells and changes caused in the gene expression profile of the cells by the PCR real time method have been evaluated; finally cells were induced to reprogram to differentiate into three germ layers tissues. The results showed that fibroblasts and cord cells subjected to viral transfection presented pluripotent cell characteristics such as morphology, positive staining for antibodies and specific gene expression, immunocytochemistry of the formed embryoid bodies also showed labeling for ectoderm, mesoderm and endoderm. Despite the time to start colonies formation is very similar (7 days for fibroblasts and 6 days for cord cells), the expansion of reprogrammed fibroblasts colonies was very slow, with the 1st was performed 30 days after transfection and 1st pass on cord colonies after 15 days. In reprogrammed fibroblast cultures were counted 81 colonies and reprogrammed cord cells culture were counted 90 colonies indicating that the reprogramming efficiency is higher in cord cells than in fibroblasts. The transposons were transfected in both cell types, but an effective reprogramming in none was not verified. It follows that the use of viral plasmid in cord cells reprogramming is more efficient than in fibroblasts and the use of transposons was infeasible in both cultures.
Biblioteca responsável: BR68.1