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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-206106

Resumo

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de desenvolver uma metodologia para purificar as RSVPs (Ram Seminal Vesicle Protein) de 14 kDa e 22 kDa. O trabalho foi desenvolvido com 16 animais da raça Morada Nova, mantidos em sistema intensivo de produção, dos quais amostras de sêmen foram coletadas semanalmente por meio de eletroejaculador, para separação do plasma seminal das células espermáticas por meio de centrifugações. As proteínas do plasma seminal foram precipitadas com etanol frio e 6,15 mg/mL de proteínas totais foram submetidas à cromatografia líquida de afinidade por gelatina, utilizando uma resina Gelatina-Sepharose acoplada a um sistema cromatográfico automatizado. As proteínas foram eluídas em quatro picos cromatográficos (P1, P2, P3 e P4), dos quais P1 e P2 continham proteínas com baixa ou nenhuma afinidade pela gelatina e P3 e P4 abrangeu as proteínas com domínios de fibronectina II com alta afinidade à gelatina. Uma alíquota de 20 g de proteínas, de cada pico, foi submetida à técnica de SDS-PAGE a 12,5% e outra alíquota contendo 20 g de proteínas, foi submetida à técnica de Western Blot, utilizando anticorpos primários anti-BSPs ovinas. Os pesos moleculares das proteínas separadas por eletroforese foram determinados com o auxílio do aplicativo Quantity One, no qual foram detectadas 5 bandas proteicas em P4, com pesos moleculares entre 12 e 30 kDa. A técnica de Western Blot demonstrou marcação específica para RSVP nos quatro picos, enquanto que P1 e P2 a marcação foi menos intensa, devido alguma forma agregada ou associada a fosfolipídios das proteínas RSVPs que acarretou em uma leve marcação na imunodetecção e em P3 e P4 a marcação foi especifica. O pico P4 foi submetido a um segundo passo cromatográfico, na coluna HiTrap Heparin HP. Neste caso, o P4 originou dois picos cromatográficos (P1 e P2) bem definidos, em que P1 abrangeu as proteínas com baixa ou nenhuma afinidade a heparina e P2, as proteínas com afinidade a heparina. As proteínas dos dois novos picos foram submetidas às técnicas de SDS-PAGE a 12,5%, e Western Blot, no qual foi possível detectar a presença de 3 bandas proteicas em P1 e 3 bandas proteicas em P2. Acredita-se que a RSVP14 e RSVP22 estejam contidas na fração sem afinidade à heparina e na fração com afinidade à gelatina, respectivamente, necessitando de mais testes para comprovar nossas teorias iniciais.

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The present study aimed to develop a methodology to purify the RSVPs (Ram Seminal Vesicle Protein) of 14 kDa and 22 kDa. The work was developed with 16 animals of the Morada Nova breed, kept in an intensive production system, which the samples of semen were collected weekly by means of electro-ejaculator, to separate seminal plasma from the sperm cells through centrifugation. Seminal plasma proteins were precipitated with cold ethanol and 6.15 mg/mL of total proteins were subjected to liquid gelatin affinity chromatography using a Gelatin-Sepharose matrix coupled to an automated chromatographic system. Proteins were eluted into four peaks (P1, P2, P3 and P4), which P1 and P2 contained proteins with low or none affinity for gelatin and P3 and P4 encompassed proteins with fibronectin II domains with high affinity to gelatin. An aliquot of 20 g of proteins from each peak was subjected to the 12.5% SDS-PAGE technique and another aliquot containing 20 g of proteins was subjected to Western Blot technique using primary ovine anti-BSPs. The molecular weights of proteins separated by electrophoresis were determined with the aid of the Quantity One Software, which 5 protein bands were detected in P4, with molecular weights between 12 and 30 kDa. The Western blot technique demonstrated specific labeling for RSVP at all four peaks, whereas P1 and P2 labeling was less intense, due to some aggregate or phospholipid-associated form of RSVP that resulted in a slight immunodetection labeling, and at P3 and P4 labeling was specific. The last peak, P4, was subjected to a second chromatographic step on the HiTrap Heparin HP column. Therefore, P4 originated two well-separated chromatographic peaks (P1 and P2), where P1 encompassed the proteins with low or none affinity to heparin and P2, the proteins with affinity to heparin. Proteins from the two new peaks were submitted to 12.5% SDS-PAGE and Western Blot, which it was possible to detect the presence of 3 protein bands in P1 and 3 protein bands in P2. It is believed that RSVP14 and RSVP22 are present in the fraction with no affinity to heparin and fraction with affinity to gelatin, respectively, requiring further testing to prove our initial theories.

Biblioteca responsável: BR68.1