Impacto da qualidade espermática sobre a fertilidade in vivo em bovinos: contribuição de marcadores mitocondriais e subpopulações espermáticas

RESUMO

A população espermática com integridade estrutural e funcionalé a que mais tem capacidade de ser fértil. O objetivo deste estudo foi identificar e quantificar de maneira acurada e profunda as características espermáticas de partidas de sêmen bovino de uso comercial que impactam sobre a fertilidade em programas de IATF. O estudo está apresentado na forma de três artigos científicos, que constituem capítulos desta tese. No artigo 1 o objetivo foi comparar partidas de sêmen bovino criopreservadas caracterizadas por classes de qualidade espermática determinadas pelas análises convencional (motilidade, vigor e morfologia), por sondas fluorescentes (integridade de membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial - PIAIA) e usando o sistema computadorizado de avaliação da motilidade espermática (CASA). Foram utilizadas 80 partidas de sêmen comercial de dois touros com baixo potencial de fertilidade. A partir dos resultados das análises de sêmen, as partidas foram separadas em três grupos Alta qualidade (A), Boa qualidade (B) e Qualidade questionável (Q). Para determinar a relação entre as três classes designadas como classe convencional, classe PIAIA e classe CASA, foi utilizado o teste de concordância para avaliar a significância do Kappa. Neste estudo, notou-se que não há concordância na qualidade espermática entre as três técnicas de avaliação convencional, sondas fluorescentes e CASA, nem entre as técnicas de avaliação convencional e CASA, mas há concordância baixa (kappa = 0,136; p= 0,053) entre as técnicas convencional e sondas fluorescentes. Assim, para a identificação de partidas de sêmen bovino com baixo potencial de fertilidade devem-se associar todas as técnicas de avaliação e excluir todas as partidas de qualidade questionável apresentada por qualquer uma das técnicas. No artigo 2 foram realizados dois experimentos com objetivo de definir quais os aspectos funcionais e estruturais espermáticos uma partida de sêmen com alto potencial fecundante devem apresentar, aplicando a citometria de fluxo para o estudo de diferentes organelas espermáticas, dando-se destaque aos marcadores mitocondriais e processos fisiológicos associados com sua função como é o estresse oxidativo. No Experimento I foram analisadas 29 partidas de sêmen usadas na IATF em vacas da raça Nelore (n=4.795), as quais, baseadas nas taxas de prenhez (TP), foram separadas em três grupos Alta fertilidade (A) com TP 60%, Média fertilidade (M) TP entre 53,0 e 59,9% e de Baixa fertilidade (B) TP <52,2%. No Experimento II foram utilizadas 18 partidas de sêmen classificadas de acordo com o índice de fertilidade de cada touro em dois grupos de Alta (n=9) e Baixa fertilidade (n=9). A classificação foi baseada em dados provenientes de 33.198 serviços. As partidas dos dois experimentos foram submetidas às análises convencional (motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática), computadorizada do movimento espermático (CASA), por microscopia de epifluorescência (membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial) e por citometria de fluxo para avaliar as estruturas espermáticas (membrana plasmática, acrossoma, e mitocôndria) e a função espermática por meio de marcadores mitocondriais, peroxidação lipídica, estresse oxidativo e nitro-oxidativo. Concluiu-se que os marcadores da função mitocondrial são bons indicadores da função e qualidade espermática; no entanto a heterogeneidade do sêmen bovino, com subpopulações espermáticas com boa e má qualidade, varia entre touros e entre partidas do mesmo touro e gera confusão na resposta de algumas análises. No artigo 3 o objetivo foi classificar no sêmen de touros subpopulações pela morfometria espermática e identificar variações destas subpopulações em partidas de sêmen com escore de fertilidade Alto e Baixo. Foram utilizadas 18 partidas de sêmen de 6 touros, sendo três touros de alta (n=9) e três de baixa fertilidade (n=9). As partidas foram submetidas a avaliação de subpopulações espermáticas em relação com a morfometria, pelo programa Imagem J, os dados foram submetidos a análise multivariada de agrupamento para formação de clusters e posteriormente ANOVA e Tukey. Foi possível discriminar a presença de subpopulações espermáticas com variação na morfometria da cabeça (SP1, SP2, SP3 e SP4), sendo qua a SP4 foi associada com fertilidade e diminuição do sucesso da fertilidade a campo. Concluiu-se que a variação na fertilidade a campo teve impacto da qualidade seminal, em particular, os marcadores mitocondriais são promissores preditores da fertilidade, no entanto, todas as características de qualidade espermática devem ser avaliadas em conjunto para determinar o potencial de fertilidade de uma amostra seminal.

ABSTRACT

The sperm population with greater functional and structural integrity is the one that most has the capacity to be fertile. The objective of this study was to identify and quantify in an accurate and deep way the sperm characteristics of bovine semen of commercial use that impact on the fertility in IATF programs. The study is presented in the form of three scientific articles, which constitute chapters of this thesis. In article 1 the objectives were to characterize cryopreserved bovine semen in sperm quality classes determined by conventional analysis (motility, vigor and morphology), by fluorescent probe analysis (plasma, acrosomal and mitochondrial membranes) and by the analysis using the computerized Evaluation of sperm motility (CASA), comparing them through concordance tests. We used 80 commercial semen outbreaks of two bulls with low fertility potential. From the results of the semen analysis, the items were divided into three groups High quality (A), Good quality (B) and Questionable quality (Q). To determine the intensity of agreement between the three classes designated as conventional class, PIAIA class and CASA class, the statistical test was used to evaluate the significance of Kappa. In the present study, there was no concordance in sperm quality between the three conventional evaluation techniques, fluorescence probes and CASA, nor between conventional and CASA evaluation techniques, but there was a low agreement (kappa = 0.136; p = 0.053) between Conventional techniques and fluorescent probes. Thus, for the identification of bovine semen with low fertility potential, all assessment techniques must be combined and all items of questionable quality presented by any of the techniques should be excluded. Article 2 Two experiments were conducted in order to define the functional and structural aspects spermatic in matches of semen with high fertilizing potential should be presented, applying flow cytometry to the study of different sperm organelles, highlighting the mitochondrial markers and physiological processes associated with their function such as oxidative stress. In the experiment I were analyzed 29 semen matches used in TAI in Nellore cows (n = 4,795), which, based on the pregnancy rate (PR) were divided into three groups high fertility (A) with TP 60 %, Mean fertility (M) TP 53.0 to 59.9% and low fertility (B) TP <52.2%. In Experiment II were used 18 classified semen matches according to the fertility rate of each bull into two groups high (n = 9), low fertility (n = 9). The classification was based on data from 33,198 services. The results of the two experiments were submitted to conventional analyzes (motility, vigor, concentration and sperm morphology), computerized motility analysis (CASA), plasma membrane integrity, intact acrosomal and mitochondrial membrane potential by epifluorescence microscopy and Flow cytometry of sperm structures (plasma membrane, acrosome, and mitochondria) and sperm function through mitochondrial markers, lipid peroxidation, oxidative and nitrooxidative stress. It was concluded that markers of mitochondrial function are good indicators of sperm function and quality; However, the heterogeneity of bovine semen, with good and poor quality sperm subpopulations, varies between bulls and between bulls and bulls, and creates confusion in the response of some analyzes. In article 3 the objective was to classify semen of bulls subpopulations by sperm morphometry and to identify variations of these subpopulations in semen matches with high and low fertility scores. Eighteen semen outbreaks of six bulls were used, three high bulls (n = 9) and three low bulls (n = 9). The data were submitted to multivariate cluster analysis to form clusters, and then ANOVA and Tukey were analyzed. The results were submitted to the evaluation of spermatic subpopulations in relation to morphometry. It was possible to discriminate the presence of sperm subpopulations with variation in head morphometry (SP1, SP2, SP3 and SP4), where SP4 was associated with fertility and decreased fertility success in the field. It was concluded that the variation in field fertility had a great impact of seminal quality, in particular, mitochondrial markers are promissory predictors of fertility, however, all characteristics of sperm quality should be evaluated together to determine fertility potential of a seminal sample.