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Papel da insulina sobre a esteroidogênese no corpo lúteo canino

RENATA DOS SANTOS SILVA.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-206559

Resumo

Hipotetizamos que a insulina através de diferentes genes desempenhe um papel fundamental na regulação da esteroidogênese, e consequentemente nas funções das células luteínicas de cadelas não prenhes. Nosso objetivo in vivo foi mapear os genes diferencialmente expressos diretamente relacionados à cascata de sinalização insulínica e a esteroidogênese no CL canino, caracterizando sua expressão gênica e proteica no diestro. Além de caracterizar a via secundária de captação de glicose também decorrente da sinalização insulínica. Cadelas não gestantes foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia a cada 10 dias entre os dias 10 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação. Os CL coletados foram utilizados para sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e validação por PCR em tempo real, e proteica por Western blotting e imunofluorescência. Nos experimentos in vitro, identificamos a diferença de respostas das células luteínicas após estímulo insulínico sob a expressão dos genes relacionados à esteroidogênese encontrados diferencialmente expressos, e ainda realizamos o bloqueio das vias PI3K, MAPK14 e MAPK1/2 para mensuração da produção de esteroides (n=4/grupo). Foram identificados sete genes diferencialmente expressos relacionados à sinalização insulínica: o IRS1, PI3KR3, PI3KCG, MAPK9, MAPK13 e MAPK14 e SOCS1, além de dois genes, CYP19A1 e HSD3B, identificados como envolvidos com a esteroidogênese. A expressão de CYP19A1 encontra-se associada positivamente com a expressão de IRS1 (r = 0,6169 P= 0,0326) e negativamente com a expressão de MAPK9 (r =-0,8851 P= 0,0001) e SOCS1 (r =-0,6628 P= 0,0188). Enquanto HSD3B encontra-se associado positivamente com MAPK9 (r = 0,7889 P=0,0621), PI3KR3 (r =0,9906 P=0,0001) e SOCS1 (r =0,9534 P=0,0032), e negativamente com IRS1 (r = -0,9555 P=0,0003) e MAPK14 (r =-0,9541 P=0,0032). A via secundária de captação de glicose mostrou que CAP1, CrKII apresentaram aumento de sua expressão no período em que ocorre o aumento da produção de P4, diferente de RAP e RHOQ que apresentaram menor expressão gênica nos dias 40, coincidindo com o aumento de E2 no diestro. Nos experimentos in vitro, sob estímulo insulínico, a expressão de CYP19A1 não apresentou diferença quando as células eram provenientes do dia 20 (P=0.0682; r=0.5745), diferentemente do dia 40 (P= <0.0001; r=0.9655), no qual houve aumento de sua expressão no grupo tratado com insulina em relação ao controle. Em relação à expressão de HSD3B, houve aumento de sua expressão no dia 20 (P=<0.0001; r=1.0) e 40 (P=0.0042; r=0.7134). A produção de P4 pelas células luteinicas cultivadas apresentou diminuição de sua expressão com o bloqueio de PI3K (P=0.0026; r=0.8671), MAPK14 (P=0.0009; r=0.9072) e MAPK1/2 (P=0.0407; r=0.6493), enquanto que a produção do E2 apresentou diminuição nos bloqueios com PI3K (P=0.0008; r=0.9676) e MAPK14 (P=<0.0001; r=0.9902), e não houve diferença de produção com o bloqueio de MAPK1/2 (P=0.0704; r=0.4639). Em conjunto, estes dados sugerem que MAPK e PI3K podem modular a esteroidogênese no CL canino, provavelmente via expressão de HSD3B e CYP19A1. A ativação da via CAP-CrKII-RHOQ-RAP, não esta envolvida neste processo. Concluimos que a insulina é capaz de modular a esteroidogênese no CL canino e que a resposta hormonal ao estímulo insulínico depende do dia do diestro.
We hypothesize that insulin plays a key role in steroidogenesis regulation and consequently the functions of luteal cells of non-pregnant female canines. In vivo goal was to map the differentially expressed genes directly related to the cascade of insulin signaling and steroidogenesis in the canine CL, characterizing its gene and protein expression along the diestrus. In addition, we intended to characterize the secondary pathway of glucose uptake also resulting from insulin signaling. Non-pregnant females were submitted to ovariosalpingohisterectomy every 10 days between days 10 and 60 (n=5/group) post- ovulation. The collected CL was used for RNA sequencing (RNA-Seq), validation by real-time PCR, and protein Western blotting and immunofluorescence. In in vitro experiments we identified different responses of luteal cells after insulin stimulation under the expression of differentially expressed steroidogenesis genes. We also performed PI3K, MAPK14 and MAPK1/ 2 pathway blockade to measure production of steroids (n = 4/group). Seven differentially expressed genes related to insulin signaling were identified: IRS1, PI3KR3, PI3KCG, MAPK9, MAPK13 and MAPK14 and SOCS1, in addition to two genes, CYP19A1 and HSD3B, identified as being involved with steroidogenesis. CYP19A1 expression is positively associated with the expression of IRS1 (r = 0.6169 P = 0.0326) and negatively with expressions of MAPK9 (r = -0.8851 P = 0.0001) and SOCS1 (r = -0.6628 P = 0.0188). HSD3B is positively associated with MAPK9 (r = 0.7889 P = 0.0621), PI3KR3 (r = 0.9906 P = 0.0001) and SOCS1 (r = 0.9534 P = 0.0032), and negatively with IRS1 (r = -0.9555 P = 0.0003) and MAPK14 (r = -0.9541 P = 0.0032). The secondary glucose uptake pathway showed that CAP1 and CrKII increased expression in the period of increased production of P4. RAP and RHOQ shows less gene expression on days 40, coinciding with the increase of E2, during diestrus. In in vitro experiments, under insulin stimulation, CYP19A1 expression did not alter in cells from day 20 (P = 0.0682; r = 0.5745). However, in cells from day 40 (P = <0.0001; r = 0.9655) expression was increased in the group treated with insulin in relation to the control. HSD3B expression increased on days 20 (P = <0.0001; r = 1.0) and 40 (P = 0.0042; r = 0.7134). The production of P4 by cultured luteal cells decreased expression with PI3K (P = 0.0026, r = 0.8671), MAPK14 (P = 0.0009, r = 0.9072) and MAPK1 / 2 (P = 0.0407, r = 0.6493 ). However, production of E2 decreased with PI3K (P = 0.0008; r = 0.9676) and MAPK14 (P = <0.0001; r = 0.9902) blockade, and did not alter with MAPK1/2 blockade (P = 0.0704, r = 0.4639). This data suggests that MAPK and PI3K can modulate steroidogenesis in canine CL, probably via HSD3B and CYP19A1 expression, and that activation of the CAP-CrKII-RHOQ-RAP pathway is not involved in this process. We conclude that insulin can modulate steroidogenesis in canine CL and that hormonal response to insulin stimulus depends on the day of the diestrus.
Biblioteca responsável: BR68.1