ESTRATÉGIAS PARA O ESTUDO DE MARCADORES MOLECULARES DA FERTILIDADE EM MODELOS ANIMAIS: PERFIL METABOLÔMICO DO PLASMA SEMINAL EM TOUROS E EXPRESSÃO DA INTEGRINA SUBUNIDADE BETA 5 NO ESPERMATOZOIDE, OÓCITO E EMBRIÃO BOVINO

RESUMO

Os metabólitos e as proteínas, incluindo as integrinas, são importantes na fisiologia reprodutiva de animais e seres humanos. Entretanto, ainda são desconhecidos os metabólitos do plasma seminal que estão associados com a fertilidade de touros e ainda não se sabe os possíveis papéis da integrina subunidade beta 5 (ITG5) na fecundação e no desenvolvimento embrionário de bovinos. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram (1) determinar o metaboloma do plasma seminal de touros com diferentes escores de fertilidades, (2) identificar metabólitos que demonstram ser potenciais marcadores de fertilidade em touros, (3) avaliar a expressão da ITG5 em espermatozoides, oócitos e embriões bovinos em fases iniciais de desenvolvimento e, (4) verificar a conservação evolutiva da ITG5 por meio de ferramentas de bioinformática. No estudo 1 foi utilizada a técnica de cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas (CG-EM) para determinar o metaboloma do plasma seminal de 16 touros com alta e baixa fertilidade. Em seguida, os dados foram submetidos a análise estatística multivariada e univariada. A partir destes resultados, análises de bioinformática foram realizadas a fim de identificar as vias metabólicas associadas com o metaboloma do plasma seminal desses touros. Sessenta e três metabólitos foram identificados no plasma seminal de touros com diferentes escores de fertilidade. A frutose foi detectada como o metabólito mais abundante, seguido pelo ácido cítrico, ácido lático, ureia e ácido fosfórico. Já androstenediona, 4-cetoglicose, D-xilofuranose, ácido 2-oxoglutárico e o ácido eritrônico foram os metabólitos menos abundantes do fluído seminal de touros. A Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) revelou uma separação distinta entre os touros de alta e de baixa fertilidade. Os metabólitos com as maiores pontuações de Importância da Variável na Projeção (VIP > 2) foram o ácido 2-oxoglutárico e a frutose. A análise do mapa de calor (heatmap), com base na pontuação de VIP, e as análises univariadas indicaram que o ácido 2-oxoglutárico foi significativamente menor (P = 0,02) e a frutose foi significativamente maior (P = 0,02) em touros de alta fertilidade comparados aos touros de baixa fertilidade. O presente estudo foi o primeiro a identificar o perfil metabolômico do plasma seminal de touros empregando a CG-EM e o primeiro a mostrar o ácido 2-oxoglutárico e a frutose como potenciais biomarcadores de fertilidade em touros. No estudo 2, os níveis de expressão da proteína ITG5 em espermatozoide de touros foi avaliada pela técnica de western blotting. A reação de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi empregada para avaliar os níveis de expressão de transcritos da ITG5 em oócitos e embriões bovinos. Além disso, ferramentas de bioinformática foram utilizadas com o intuito de determinar a conservação evolutiva da proteína ITG5 entre várias espécies. Os resultados do western blotting confirmaram a presença da proteína ITG5 em espermatozoides de touros e, com base nas análises de RT-qPCR, foi observado que a ITG5 está presente nos óocitos e que os níveis dela são significativamente mais elevados nos embriões bovinos de 2 células, seguidos pelos embriões de 8-16 células. As análises de bioinformática mostraram que a ITG5 é conservada em várias espécies. Desta forma, nossos resultados demonstram a presença da ITG5 em espermatozoides, bem como em oócitos e embriões bovinos em estágios iniciais se desenvolvimento, sugerindo um importante papel da ITG5 na fecundação e no desenvolvimento embrionário inicial desta espécie.

ABSTRACT

Metabolites and proteins including integrins are important in the reproductive physiology of animals and humans. However, seminal plasma metabolites that are associated with bull fertility are still unknown and the possible roles of the integrin subunit beta 5 (ITG5) in fertilization and embryonic development of bovine are not yet known. Therefore, the objectives of the present study were (1) to determine comprehensive metabolome of seminal plasma from Holstein bulls with differing fertility scores, and (2) to ascertain potential metabolites as biomarkers associated with bull fertility, (3) to evaluate expression of ITG5 in sperm, oocytes and early bovine embryos, and (4) to ascertain the evolutionary conservation of ITG5. In the study 1, chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was employed to determine seminal plasma metabolome from 16 Holstein bulls with two fertility scores. Soon after, data were evaluated using multivariate and univariate analyses. Bioinformatics analyzes were performed in order to identify metabolic pathways associated with bulls seminal plasma metabolites. Our results showed that 63 metabolites were identified in bull seminal plasma. Fructose was the most abundant metabolite detected followed by citric acid, lactic acid, urea, and phosphoric acid. Androstenedione, 4-ketoglucose, D-xylofuranose, 2-oxoglutaric acid and erythronic acid were the least predominant metabolites found in bulls seminal fluid. PLS-DA showed a distinct separation between high and low fertility bulls as regard to scores plot. Metabolites with the greatest VIP score (VIP > 2) were 2-oxoglutaric acid and fructose. Heat-map analysis based on VIP score and univariate analysis indicated that 2-oxoglutaric acid was less (P = 0.02) and fructose was significantly greater (P = 0.02) in high-fertility bulls as compared to low-fertility bulls. To the best of our knowledge the current study is the first to identify the comprehensive metabolomic profiling of bull seminal plasma with differing fertility score and to present the potential of metabolites such as 2-oxoglutaric acid and fructose as biomarkers of bull fertility using GC-MS. In the study 2, expression levels of ITG5 protein in bull sperm were evaluated by western blotting. Real time-qPCR was carried out to evaluate the expression levels of ITG5 transcripts in oocytes and embryos from bovine species. In addition, bioinformatic tools were performed to determine to evolutionary conservation of ITG5 across species. Western blotting results showed the presence of ITG5 on bull spermatozoa. Moreover, RT-qPCR results demonstrated that ITG5 is present in bovine oocytes and that ITG5 levels were significantly higher in 2-cell embryos and 8-16 cell embryos. Bioinformatics analyses showed that ITG5 is conserved across species. Therefore, our results showed the presence of ITG5 in spermatozoa as well as oocytes and embryos in early stages of development, suggesting an important role of ITG5 upon fecundation and early embryo development in the bovine species.