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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-206858

Resumo

QUEIROZ, C.M. Vesículas Extracelulares e Meio Condicionado de Células Tronco Mesenquimais e Seu Potencial Imunomodulador em Explantes Endometriais Bovinos - Botucatu, 2017, 90f. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Palavras-chave: exossomos, microvesículas, inflamação, biotecnologia. O presente estudo teve como objetivo isolar, cultivar e caracterizar as células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) bovino, obtenção de vesículas extracelulares e meio condicionado do cultivo celular (MC) e avaliação do seu potencial imunomodulador em cultivo de explantes endometriais bovinos. Para isso, as CTM-TA foram coletadas (n=3) de tecido adiposo e sofreram isolamento, processamento e cultivo. As amostras foram submetidas à análise citogenética, imunofenotípica (CD44, CD29, vimentina, CD34 e MHCII), de viabilidade e de diferenciação (adipogênica, osteogênica e condrogênica), e então criopreservadas. Após descongelamento e expansão, o meio condicionado do cultivo celular foi submetido à ultracentrifugações para obtenção das vesículas extracelulares que foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e Western Blot (Alix e CD9). Explantes de endométrios bovinos (n=7) provenientes de abatedouro foram submetidos a cultivo e desafio com LPS (3µg/mL) por 48 horas. Os grupos experimentais foram CN (controle negativo, sem desafio com LPS), CP (controle positivo, apenas desafio com LPS), V (desafio com LPS e adição de vesículas extracelulares) e MC (desafio com LPS e adição de meio condicionado). Avaliou-se secreção de PGF2 e IL-1 por Elisa, morfologia do tecido através de histopatologia, expressão tecidual de Fas-L, TLR-4, PGDH e PGF2-R por Imunoistoquímica. No cultivo celular das CTM-TA foi obtida uma população celular homogênea e fibroblastóide, com aderência ao plástico, expressando baixos níveis de CD34 e MHCII, e altos níveis de CD29, CD44 e vimentina. As células foram cromossomicamente estáveis, com boa viabilidade antes e após congelamento, e secretaram vesículas de aproximadamente 10 a 200nm de diâmetro, positivas para Alix e CD9 no Western Blot indicando a presença de exossomos (Exos) em uma população mista VEs. Não houve efeito de tratamento para secreção de PGF2 e IL-1, nem na imunomarcação de TLR-4, Fas-L, PGDH e PGF2-R. Houve mudanças morfológicas como hipertrofia, atrofia e hiperplasia celular, bem como dilatação do lúmen glandular, independente do tratamento. Houve diminuição na densidade das glândulas após cultivo, devido à inflamação. Conclui-se que foi possível isolar, cultivar, caracterizar e criopreservar CTM-TA de bovinos, e estas células secretam VEs no meio condicionado de cultivo. Contudo, os achados apontam para inflamação no modelo in vitro de cultivo que se sobrepôs aos efeitos inflamatórios do desafio com LPS. Ademais, os tratamentos com V ou MC não resultaram em efeito imunomodulatório.

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QUEIROZ, C.M. Extracellular Vesicles and Conditioned Medium from Mesenchymal Stem Cells and its Immunomodulatory Potential in Bovine Endometrial Explants - Botucatu, 2017, 90f. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, São Paulo State University Júlio de Mesquita Filho. Keywords: exossomes, microvesicles, inflammation, biotechnology. The present study aimed to isolate, culture and characterize bovine adipose tissue mesenchymal stem cells (AT-MSC) and obtain extracellular vesicles (EVs) and conditioned medium (CM) from the cell culture in order to evaluate its in vitro immunomodulatory potential in bovine endometrial explants. For this, adipose tissue were collected (n=3) and underwent isolation, processing and culture. The samples were submitted to cytogenetic, immunophenotypic characterization (CD44, CD29, vimentin, CD34 and MHCII), viability and differentiation (adipogenic, osteogenic and chondrogenic), and then cryopreserved. After thawing and expansion, the CM of the cell culture was subjected to ultracentrifugation to obtain the EVs that were characterized by electron microscopy and Western Blot (Alix and CD9). Bovine endometrium from slaughterhouse (n=7) were cultured and challenged with LPS. The experimental groups were CN (negative control, no challenge with LPS), CP (positive control, challenge with LPS), V (challenge with LPS and addition of EVs) and MC (challenge with LPS and addition of CM). PGF2 and IL-1 secretion was evaluated by Elisa, tissue morphology and Fas-L, TLR-4, PGDH and PGF2-R protein expression by Immunohistochemistry. A monolayer with fibroblastoid cell population having plastic adherence, expressing low levels of CD34 and MHCII, and high levels of CD29, CD44 and vimentin was obtained in CTM-TA cell culture. The cells were chromosomally stable, with good viability before and after cryopreservation, and secreted EVs of approximately 10 to 200 nm in diameter, positive for Alix and CD9 in Western Blot indicating the presence of exosomes (Exos) in a mixed EVs population. There was no treatment effect for PGF2 and IL-1 secretion, nor in the immunolabeling of TLR-4, Fas-L, PGDH and PGF2-R. There were morphological changes such as hypertrophy, atrophy and cellular hyperplasia, as well as dilation of the glandular lumen, regardless of the treatment. There was a decrease in the density of the glands after culture due to inflammation. It was concluded that it is possible to isolate, culture, characterize and cryopreserve CTM-TA from bovines, and these cells secrete EVs in CM. However, the findings point to inflammation in the in vitro culture model that overlapped the inflammatory effects of LPS challenge. In addition, the treatments with EVs or CM did not result in immunomodulatory effect.

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