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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-207037

Resumo

Avanços para um diagnóstico mais eficiente da leishmaniose visceral faz-se necessário, pois essa doença pode ser fatal, se não tratada. Apesar do contínuo desenvolvimento de testes de imunodiagnóstico, limitações intrínsecas de cada técnica resultam em um diagnóstico incerto. Durante os últimos anos, nosso grupo vem desenvolvendo estudos de imunogenômica para a busca de novos antígenos que sejam mais sensíveis e específicos. Utilizando metodologias de mineração de dados, é possível identificar proteínas ou peptídeos presentes nos parasitos que exibem certa homologia a moléculas do hospedeiro que estão associadas à resposta imunológica, que podem ser o diferencial na tentativa de melhoria de testes diagnósticos. Neste contexto, o presente estudo identificou e testou três proteínas de Leishmania que apresentam similaridade com proteínas presentes no banco de dados ImmunomeBase, o qual dispõe de proteínas de Homo sapiens com função biológica associada a processos de defesa do hospedeiro previamente caracterizadas. Foram selecionados para esse trabalho os genes que codificam a proteína ATP difosfohidrolase de L. infantum (EctoLi), a proteína de ligação ao GTP de L. infantum (MyxoLi) e de L. mexicana (MyxoLm) e a proteína tirosina fosfatase de L. braziliensis (TyroLb). Esses alvos foram expressos em um sistema heterólogo, utilizando como vetor o plasmídeo pET28a-TEV e como sistema de expressão Escherichia coli da cepa BL21 e Arctic Express. Após a purificação por cromatografia de afinidade, as proteínas foram utilizadas como antígenos no teste sorológico por ELISA para leishmaniose visceral humana (LVH) e canina (LVC). As propriedades antigênicas das proteínas foram avaliadas e epítopos lineares de célula B foram identificados. Na validação com soros de cães, a eficiência do teste foi capaz de discriminar as amostras positivas de negativas e a qualidade dos testes com os antígenos recombinantes, baseada na área sob a curva ROC, foi entre bom e excelente, sugerindo que estas proteínas constituem bons candidatos para uma triagem inicial dos animais e/ou teste confirmatório de LVC. Em destaque, os testes com EctoLi e MyxoLi apresentaram alta especificidade, sendo úteis não só para determinar os verdadeiros positivos e verdadeiros negativos, como também para distinguir reações cruzadas. O valor preditivo positivo e a acurácia para esses testes foram superiores ao observado para o kit EIE-LVC Bio-Manguinhos, sugerindo que os antígenos testados no trabalho são melhores candidatos para o diagnóstico de LVC. Na validação com soros de pacientes humanos, a proteína recombinante EctoLi demonstrou um bom desempenho no teste diagnóstico e destacou-se pela alta especificidade, sendo capaz de separar significativamente pacientes infectados de não infectados e com doença de Chagas, sugerindo ser um bom candidato para teste confirmatório de LVH. Em adição, a proteína truncada MyxoTLm mostrou ser uma boa candidata para o sorodiagnóstico de tripanossomatídeos (Leishmania e Trypanossoma cruzi) com 100% de especificidade e 90% sensibilidade, sendo seu uso sugerido para triagem em bancos de sangue. A partir dos dados obtidos, nosso trabalho sugere que a estratégia do ELISA baseado em proteínas recombinantes, homólogas ao sistema imune do hospedeiro, pode ser útil para o desenvolvimento de um teste sensível e altamente específico para o sorodiagnóstico desta parasitose.

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Advances seeking a more efficient diagnosis of visceral leishmaniasis are still necessary, since this disease can be fatal if untreated. Despite the continuous development of immunodiagnostic tests, intrinsic limitations of each technique usually lead to an uncertain diagnosis. Over the last years, our group has been focused in immunogenomic studies for the search of new antigen candidates that would be more sensitive and specific. Using data mining methodologies, it is possible to identify proteins or peptides present in the parasites with homology to host molecules associated with the immune response, which may be the differential approach in an attempt to improve the performance diagnostic tests. In this context, the present study identified and tested three Leishmania proteins that present similarity to proteins present in the ImmunomeBase database, which comprises Homo sapiens proteins with biological function associated with previously characterized host defense processes. It was selected genes coding for ATP diphosphohydrolase protein of the Leishmania. infantum (EctoLi), GTP binding protein of the L. infantum (MyxoLi) and L. mexicana (MyxoLm), and tyrosine phosphatase protein of the L. braziliensis (TyroLb). These targets were expressed in a heterologous system using the plasmid pET28a-TEV as vector and Escherichia coli strain BL21 and Arctic Express as the expression system. After purification by affinity chromatography, the proteins were used as antigens in the ELISA test for human visceral leishmaniasis (HVL) and canine (CVL). The antigenic properties of the proteins were evaluated and the linear B-cell epitopes derived from these targets were identified. When proteins were tested with the dog sera, the efficiency of the test was able to discriminate the positive from the negative samples and the quality of the tests with the recombinant antigens, based on the area under the ROC curve, was between good and excellent, suggesting the use of these proteins for an initial screening of the animals and/or confirmatory test for CVL. In particular, EctoLi and MyxoLi showed high specificity, being useful not only to determine true positives and true negatives, but also to distinguish cross-reactions. The positive predictive value and the accuracy for the assays using these proteins were higher when compared to the EIE-LVC kit Bio-Manguinhos, suggesting that the use of the antigens provides are better candidates for the diagnosis of LVC. When tested with human sera, the recombinant protein EctoLi demonstrated a good performance for diagnostic test screening and distinguished by the high specificity, being able to significantly separate infected from uninfected patients and with Chagas disease, suggesting to be a good candidate for HVL confirmatory test. In addition, the truncated protein MyxoTLm proved to be a good candidate for the serodiagnosis of trypanosomatids (Leishmania and Trypanosoma cruzi) with 100% specificity and 90% sensitivity, and our results suggest the possible use in blood bank screening. Taken together, our work suggests that the ELISA strategy based on recombinant proteins, homologous to the host immune system, could be an useful approach for the development of a more sensitive and specific tests for the serodiagnosis of this parasitosis.

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