MÉTODOS DE PREPARAÇÃO ESPERMÁTICA EM SÊMEN OVINO CRIOPRESERVADO

RESUMO

A preparação espermática é uma etapa importante para aplicação de biotécnicas reprodutivas. Nos estudos I e II, objetivou-se avaliar o efeito de métodos de seleção espermática sobre parâmetros do sêmen ovino ao longo do tempo. Em ambos os experimentos, foi utilizado sêmen descongelado de 10 carneiros da raça Santa Inês. No estudo I, os métodos de seleção testados foram Swim-up (SU), gradiente de Percoll, mini-Percoll e lavagem por centrifugação, além do grupo controle. No estudo II, foram comparados o gradiente de Percoll convencional (controle) e quatro protocolos de mini-Percoll. Em ambos os estudos, as amostras foram incubadas a 37 °C por 1 h, 2 h e 3 h, após a seleção. Os parâmetros avaliados foram taxa de recuperação, motilidade, integridade de membrana plasmática (MP), morfologia e capacitação espermática. O estudo III, teve como objetivo comparar a capacitação espermática, através da heparina, das espécies bovina, caprina e ovina após incubação. As amostras foram selecionadas pelo mini-Percoll e incubadas por 1,5 h, 3 h, 6 h e 18 h. Os parâmetros avaliados foram motilidade, integridade de MP, aglutinação e capacitação. No estudo I, a menor (P<0,05) taxa de recuperação foi após o SU e as demais técnicas não diferiram (P>0,05) entre si. A maioria dos parâmetros da cinética não foi afetada (P>0,05) pela seleção a 0h, somente SU obteve maiores valores (P<0,05) para VSL (41,8 ± 11,1 µm/s) e VAP (46,9 ± 11,2 µm/s). O SU apresentou valores maiores (P<0,05) para a maioria dos parâmetros de cinética avaliados ao longo da incubação e obteve uma maior recuperação (P<0,05) de células intactas (32,1 ± 6,4%). Percoll, mini-Percoll e SU apresentaram mais células reagidas (P<0,05) ao longo do tempo. No estudo II, a média de recuperação espermática (9,1 ± 1,4%) entre todos os tratamentos foi semelhante (P>0,05), bem como a maioria dos valores de motilidade, integridade de MP e status da capacitação (P>0,05). O VCL foi maior (P<0,05) após alguns protocolos de mini-Percoll do que após o Percoll tradicional. No estudo III, a suplementação de heparina não resultou em benefícios (P>0,05) aos parâmetros avaliados. Entretanto, houve uma menor taxa (P<0,05) de aglutinação na presença de heparina na espécie ovina. Ovinos apresentaram uma taxa menor (P<0,05) de células intactas e maior (P<0,05) de aglutinação ao longo da incubação. Neste contexto, conclui-se que o uso de protocolos de mini gradientes abre novas perspectivas, minimizando prejuízos à célula espermática, custos e tempo de processamento. Além disso, foi observado que a heparina não apresentou efeitos na capacitação espermática, e quando associado com a seleção pelo mini-Percoll, a manipulação do sêmen descongelado de ovinos, caprinos e bovinos pode tornar-se mais prática e barata.

ABSTRACT

Sperm preparation is an important step in implementing of most reproductive biotechnologies. The goal of tests I and II, was to evaluate different methods of sperm selection and incubation in different sperm parameters of ovine semen. In both experiments, frozen/thawed commercial semen from 10 Santa Inês sheep was used. In test I, the methods of sperm selection were SU (SU), Percoll gradient, mini-Percoll and washing by centrifugation. Parallel to the selection, a control group free from the influence of the selection was used. In test II, a comparison was made between conventional Percoll gradient (control) and four different mini-Percoll protocols. The samples were subjected to incubation at 37 °C for 1 h, 2 h and 3 h after sperm selection. The analyzed sperm parameters were sperm recovery rate, motility, individual kinetic, plasma membrane integrity (PM), morphology and capacitation. Test IIl aimed to characterize the sperm capacitation, using heparin, of bovine, caprine and ovine species after incubation. Samples were thawed, selected by mini-Percoll and incubated for 1.5 h, 3 h, 6 h and 18 h. The analyzed sperm parameters were motility, kinetic, PM integrity, agglutination and capacitation. Regarding to test I, the lowest (P < 0.05) recovery rate was recorded after swim-up (1.0 ± 0.3%), whilst the others were similar (P > 0.05). Most part of motility parameters were not affected (P > 0.05) by the technique at 0 h; just swim-up obtained higher (P < 0.05) values for VSL (41.8 ± 11.1) and VAP (46.9 ± 11.2). Overall, swim-up presented higher (P < 0.05) values for most of motility parameters over time of incubation. The control group led to more (P < 0.05) capacitated cells (46.8 ± 2.3%), whilst Percoll, mini-Percoll and swim-up were similar (~33%; P > 0.05), regardless of interval incubation. However, the latter three techniques presented more (P < 0.05) reacted cells. Swim-up recovered a higher (P < 0.05) number of intact cells (32.1 ± 6.4%). In test II, the sperm recovery rate averaged 9.1 ± 1.4%, and most motility parameters were similar (P > 0.05) among protocols. VCL (µm/s) was higher (P < 0.05) after MP-II, III and IV (66.1 ± 4.5) than traditional Percoll (46.3 ± 4.9). Capacitation status and PM integrity were similar (P > 0.05) among treatments. Regarding to test III, heparin supplementation resulted in no extra benefits (P>0.05) to the parameters evaluated. However, a lower (P<0.05) rate of sperm agglutination was observed in heparin presence in ovine. Additionally, ovine showed a lower (P<0.05) rate of intact cells and a higher (P<0.05) agglutination rate along the incubation compared to the others species. In conclusion, the use of mini gradient protocols can bring new perspectives, decreasing harms to sperm, costs and processing time. Moreover, it has been observed heparin did not show effect on capacitation, and when it is associated with mini-Percoll, can become frozen-thaw spermatozoa manipulation of ovine, caprine and bovine more practical and cheaper.