Detecção molecular de Ehrlichia spp., Anaplasma spp., Rickettsia spp. e agentes da Ordem Piroplasmida em cães, e seus carrapatos, da região metropolitana da Província de Piura, Piura-Peru.

RESUMO

Erliquiose, Rickettsiose e Babesiose têm sido identificadas como causa crescente de morbidade e mortalidade de caninos e, em alguns países, do homem, em virtude da maior exposição a locais onde é comum a presença de carrapatos. O objetivo deste trabalho foi obter informações epidemiológicas sobre as infecções e presença dos agentes de membros Ordem Rickettsiales e agentes da Ordem Piroplasmida, que acometem cães, e seus carrapatos, da região Metropolitana da Província de Piura, por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Nested-PCR, polimorfismos de restrição de fragmentos amplificados (RFLP), Sequenciamento e Analise filogenética, assim como determinar as espécies envolvidas nas infecções, e conhecer a fauna de Ixodídeos presentes nessa região. Além das amostras de sangue (216) e carrapatos (984), foram coletadas informações sobre os cães e seus proprietários como faixa etária, sexo, presença de carrapatos, estrato socioeconômico e convivência com outros animais. Dos 984 carrapatos, apenas três espécies de carrapatos foram identificadas, Riphicephalus sanguineus (977), Amblyomma triste (seis) e Amblyomma tigrinum (um). Estes foram classificados morfologicamente por estádio, espécie e sexo, ficando 67,3% (348/517) fêmeas adultas (armazenadas individualmente), 22,8% (118/517) machos adultos (armazenados em pool de até sete exemplares) e 9,9% (51/517) ninfas (armazenadas em pool de até dez exemplares do mesmo animal e da mesma espécie). Utilizando-se os iniciadores ECC/ECB, ECAN/HE3 e PLATYS/HE3, verificou-se mediante PCR e Nested-PCR, frequências de 18,5% (40/216), 52,5%(21/40), 35,0%(14/40) e 20%(8/40) para agentes da Família Anaplasmataceae, E. canis, A. platys e coinfecção entre estas duas espécies, respectivamente, no DNA extraído dos cães, ficando 32,5%(13/40) das amostras negativas, para estas duas espécies pela Nested-PCR, mas diagnosticadas como E. canis e A. platys pelo sequenciamento. Ao se considerar as variáveis de sexo (p=0,034), presença de carrapatos (p=0,0001) e estrato socioeconômico (p=0,001), verificou-se que houve associação entre os diferentes grupos e a infecção para agentes da Família Anaplasmataceae em cães. A análise filogenética, confirmou a presença das espécies Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Ehrlichia sp., no DNA extraído dos cães. A frequência de carrapatos positivos para agentes da Família Anaplasmataceae, mediante PCR, foi 15,0% (78/517). Entretanto, apenas duas sequências resultaram em boa qualidade para análise no GenBank, identificando o agente envolvido como E. canis. Além disso, dos 216 cães avaliados e 517 "pools" de carrapatos, 1,4% (3/216) e 0%(0/517) foram positivos para Babesia sp. na PCR utilizando os iniciadores PIRO A e PIRO B. Na RFLP demonstrou-se um padrão de clivagem, em todas as amostras, compatível com B. vogeli. As sequência evidenciaram um 99% de identidade para B. vogeli. Na avaliação de agentes rickettsiais, observou-se mediante PCR e sequenciamento, uma taxa de infecção em carrapatos de 0,2% (1/517). Essa amostra foi positiva para gltA, porém, negativa para ompA, ompB e htrA. A análise filogenética mostrou que a sequência avaliada se agrupou no clado de R. felis. Demonstrando pela primeira vez, mediante técnicas moleculares a presença de agentes de membros da Ordem Rickettsiales e agentes da Ordem Piroplasmida em cães, e seus carrapatos, na Província de Piura.

ABSTRACT

Rickettsiosis and babesiosis are important causes of morbidity and mortality in dogs and humans living in tick-infested areas. Ticks are important as vectors and reservoirs for these disease transmission agents. The aim of this work was to obtain epidemiological information regarding infections and the presence of members of the Anaplasmataceae family, and Rickettsial and piroplasmidas tick-borne agents in the metropolitan region of Piura, Peru. We performed polymerase chain reaction (PCR), nested-PCR, restriction fragment length polymorphism (RFLP), and sequencing and phylogenetic analyses in order to determine the species involved in infections and the fauna of ixodid ticks in that region. 216 blood samples and 984 ticks were collected from dogs from the region of Piura. We could identify three different tick species 977 specimens of Riphicephalus sanguineus (180 nymphs, 410 females, and 387 males), six adult females of Amblyomma triste and one adult male of Amblyomma tigrinum. The total 984 ticks were further classified morphologically by stage, species, and sex. Our data shows that from the total of ticks collected, 67.3% (348/517) were adult female ticks (stored individually), 22.8% (118/517) were adult male ticks (stored in pools of up to seven specimens), and 9.90% (51/517) were nymphs (stored in pools of 10 specimens of the same specie). The information of the dogs including sex, age presence of ticks, coexistence with other animals and socio-economic status was registered and added by the owners. DNA from blood revealed that 18.5% (40/216), 52.5% (21/40), 35.0% (14/40) and 20% (8/40) were agents of the Family Anaplasmataceae, E. canis, A. Platys, and coinfection between these two species in dogs, respectively. 32.5% (13/40) of the negative samples by Nested-PCR for these two species, were diagnosed as E. canis and A. platys by sequencing. Positive sequences detected showed 100% similarity with the species E. canis and A. platys reported in GenBank. There was a significant association between Anaplasmataceae family infection in dogs and the following variables sex (P=0,034), presence of ticks (P=0,0001), and socio-economic status (P=0,001).The frequency of positive ticks for agents of the family Anaplasmataceae, by PCR, was 15.0% (78/517). However, only two samples showed good quality sequences, and were positive for E. Canis by sequencing and phylogenetic analyses. Furthermore, from the 216 dogs evaluated, three (1.40%) were positive for Babesia sp. by PCR. All positive samples, analyzed by RFLP, revealed a cleavage compatible with B. vogeli. These sequences showed 99% identity with sequences of positive samples for B. vogeli. Not all tick samples were positively amplified by PCR with the primers PIRO A and PIRO B. During the evaluation of rickettsial agents by PCR and sequencing, the tick infection rate was 0.20% (1/517). Those samples were positive for gltA and negative for ompA, ompB and 17KD. The phylogenetic analysis showed that the sequence evaluated was grouped in the R. felis side.