EFEITO DE FATORES DE CRESCIMENTO NO CULTIVO IN SITU SOBRE O DESENVOLVIMENTO E APOPTOSE DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS OVINOS

RESUMO

A manipulação e cultivo de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais é uma das principais ferramentas utilizadas atualmente para estudos da foliculogênese inicial e resgate de oócitos primários, para cultivá-los in vitro até a maturação. O objetivo deste trabalho foi estudar um sistema de cultivo eficiente para a etapa do desenvolvimento folicular pré-antral, utilizando IGF-1, EGF e FSH. Foi realizado o cultivo in situ de fragmentos de córtex ovariano de ovinos, cultivados por oito dias em MEM+ adicionado de IGF-1, FSH e EGF, isolados e/ou associados. Amostras foram analisadas por histologia clássica e imuno-histoquímica (TUNEL), foram mensurados os diâmetros foliculares e os folículos classificados em primordiais e em desenvolvimento (primários e secundários), em normais/anormais e com ou sem apoptose. As expressões relativas de RNAm dos genes relacionados à apoptose, Bcl2, Bax e Caspases 3 e 9, nos fragmentos ovarianos, foram avaliadas pela técnica de PCR em tempo real. O cultivo com diferentes concentrações de IGF-1, demonstrou que 50 ng/mL proporcionou maior ativação do crescimento dos folículos, comparados às outras concentrações (P < 0,05). O IGF-1 associado ao FSH melhorou a ativação folicular, a normalidade dos folículos e reduziu a apoptose folicular (P < 0,05). A expressão relativa da Caspase 9 foi reduzida (P < 0,05) nos cultivos contendo IGF-1, associado ou não ao FSH, porém não foi observada diferença para os outros genes (P > 0,05). Da mesma forma a associação de IGF-1 ao EGF com ou sem adição de FSH foi eficiente para melhoria do cultivo in vitro de fragmentos ovarianos de ovelhas por 8 dias, seja na qualidade morfológica, quanto na redução da apoptose (P < 0,05). Conclui-se que 50 ng/mL de IGF-1 é a concentração mais eficaz para o desenvolvimento de folículos pré-antrais cultivados inclusos no tecido ovariano ovino, pelo período de 8 dias. A associação de IGF-1 ao EGF ou ao FSH são eficientes para melhorar o desenvolvimento dos folículos e reduzir os níveis de apoptose nestas condições de cultivo, favorecendo o equilíbrio entre os fatores apoptóticos estudados.

ABSTRACT

The manipulation and culture of oocytes included in ovarian preantral follicles is one of the main tools currently used for studies of the initial folliculogenesis and rescue of primary oocytes, to cultivate them in vitro until maturation. The objective of this research was to study an efficient culture system for this stage of follicles, using IGF-1, EGF and FSH. Ovarian cortex fragments from sheep, were cultured in situ for eight days in MEM+ added with IGF-1, FSH and EGF, isolated and/or associated. Samples were analyzed by classical histology and immunohistochemistry (TUNEL), in order to measare follicular diameters and classify follicles as primordial and developing (primary and secondary), normal / abnormal and with or without apoptosis. The relative mRNA expressions of the apoptosis-related genes, Bcl2, Bax and Caspases 3 and 9 in the ovarian fragments were evaluated by the real-time PCR technique. The culture with different concentrations of IGF-1, demonstrated that 50 ng/mL provided greater activation of follicle growth, compared to the other concentrations (P <0.05). FSH- associated IGF-1 improved follicular activation, normality, and reduced apoptosis (P <0.05). The relative expression of Caspase 9 was reduced (P <0.05) in cultures containing IGF-1, associated or not to FSH, but no difference was observed for the other genes (P> 0.05). Likewise, the association of IGF-1 to EGF with or without FSH addition was efficient for improving the in vitro culture of ovarian sheep fragments for 8 days, either in morphological quality or in the reduction of apoptosis (P <0.05 ). It is concluded that 50 ng/ml of IGF-1 is the most effective concentration for the development of cultured preantral follicles included in ovary ovarian tissue, for 8 days. The association of IGF-1 to EGF or FSH is efficient to improve the development of follicles and reduce the levels of apoptosis in these culture conditions, favoring the balance between the studied apoptotic factors.