Portal de Pesquisa da BVS Veterinária

Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-208015

Resumo

Os objetivos da presente tese foram: 1) Avaliar o efeito da adição do hormônio do crescimento (GH) e do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) isoladamente ou em associação, bem como de forma fixa ou sequencial sobre o cultivo in vitro de folículos (CIVF) pré-antrais (FPs) e antrais iniciais (FAs) isolados (Fase I); 2) Analisar o efeito do sistema de maturação in vitro (MIV) (individual vs. em grupo) sobre a produção de oócitos maturos, além de investigar o efeito do tempo de cultivo sobre o CIVF de FAs (Fase II); 3) Verificar se a linhaça na dieta afeta a eficiência do CIVF de FAs (Fase III). Na Fase I, FPs e FAs foram cultivados em: MEM+ (Controle), ou MEM+ suplementado com 50 ng/mL de GH, 100 ng/mL de VEGF, a combinação de ambos (GH+VEGF), GH durante os primeiros 12 dias e VEGF a partir do dia 12 até o final do cultivo (GH/VEGF) e vice-versa (VEGF/GH). Posteriormente, os complexos cumulus-oócito (CCOs) recuperados foram maturados in vitro. Foram avaliados: a morfologia folicular, as taxas de crescimento e de formação de antro, a produção de estradiol (E2), de progesterona (P4) e de testosterona (T), a viabilidade e o estágio meiótico dos oócitos, bem como a expressão de RNAm do receptor do hormônio luteinizante (LHR), do hormônio anti-mülleriano (Amh), da hialironano sintase-2 (HAS2), e da prostaglandina endoperóxido sintase-2 (PTGS2) no cúmulus, e de três enzimas esteroidogênicas (CYP17, CYP19A1 e 3HSD) na parede folicular. Na Fase II, os CCOs crescidos in vivo foram submetidos a MIV em grupos (10 CCOs / gota de 100 L) ou individualmente (1 CCO / gota de 10 L). Além disso, FAs foram cultivados no melhor tratamento da Fase I por 12 (CIVF-12) ou 18 dias (CIVF-18), seguido da MIV individual dos CCOs recuperados. Avaliou-se a morfologia e crescimento foliculares, a produção de E2, e a configuração da cromatina de oócitos antes do CIVF, bem como antes e depois da MIV. Para a Fase III, FAs procedentes de animais alimentados com duas dietas diferentes (Controle e Linhaça) foram submetidos à CIVF e MIV como descrito na Fase I. Após a MIV, todos os oócitos foram fecundados in vitro por 18 h, seguido do cultivo in vitro dos presumíveis zigotos por mais 48 h. No dia 3 pós-fecundação, todos os embriões clivados foram transferidos no oviduto de 3 receptoras. Trinta e seis dias depois, avaliou-se a possível prenhez por ultrassonografia. Os parâmetros avaliados na Fase III foram: a morfologia folicular, a produção de E2, o diâmetro oocitário, fecundação e produção embrionária. Na Fase I, os FPs e FAs se comportaram de forma diferente quando submetidos as mesmas condições experimentais. O tratamento GH para FAs apresentou o maior (P < 0,05) diâmetro oocitário médio (117, 7 m), e as maiores (P < 0,05) taxas de maturação meiótica (42,5%). Na Fase II, o sistema de MIV individual não afeitou negativamente a maturação oocitária. O tratamento CIVF-18 promoveu as maiores (P < 0,05) taxas de oócitos em metáfase II (MII) (46,2%) e o maior (P < 0,05) diâmetro oocitário médio. Também, observou-se que os folículos com uma taxa de crescimento diária > 7,1 m e que atingiram pelo menos 600 m de diâmetro, foram mais propensos (P < 0,05) a produzir oócitos capazes de atingir a MII. Finalmente, na Fase III a linhaça não afeitou a foliculogênese in vitro, mais sim aumentou (P < 0,05) as taxas de recuperação de oócitos 110 m e diminuiu (P < 0,05) as taxas de fecundação, embora não tenha afeitado as taxas de clivagem.

---

The main goals of the present thesis were: 1) to evaluate the effect of growth hormone (GH) and vascular endothelial growth factor (VEGF) added alone, sequentially or in combination on the in vitro culture of two different follicular categories: preantral (PAF) and early antral (EAF) (Phase I); 2) to investigate the effect of the in vitro maturation (IVM) system (individual vs. in group) on the production of metaphase II (MII) oocytes, as well as the effect of the culture period (12 vs. 18 days) on EAFs development (Phase II); 3) To verify if a linseed-supplemented diet affects the in vitro follicle culture (IVFC) (Phase III). In the Phase I, PAFs and EAFs were cultured as follows: MEM+ (Control), or MEM+ supplemented with 50 ng/mL GH, 100 ng/mL VEGF, the combination of both (GH+VEGF), GH during the first 12 days and VEGF from day 12 until the end of the culture (GH/VEGF) and vice versa (VEGF/GH). Afterwards, recovered cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in vitro. It was evaluated: follicle morphology, levels of estradiol (E2), progesterone (P4) and testosterone (T), oocyte viability and meiotic stage, as well as mRNA expression of LHR (Luteinizing hormone receptor), Amh (Anti-müllerian hormone), HAS2 (Hyaluronan synthase 2), and PTGS2 (Prostaglandin endoperoxide synthase 2) in cumulus cells, and three steroidogenic enzymes (CYP17, CYP19A1, and 3HSD) in follicular walls. In the Phase II, in vivo grown COCs were submitted to IVM either individually (1 COC/10 L-drop) or in group (10 COCs/100 L-drop). Also, EAFs were cultured using the best treatment of the Phase I for 12 (IVFC-12) or 18 days (IVFC-18), followed by individual IVM of the recovered COCs. Follicular morphology and growth, E2 production, and oocyte chromatin configuration were evaluated before IVFC and before and after IVM. Finally, for the Phase III, EAFs from animals fed with two different diets (Control or Linseed) were submitted to IVFC and IVM as described in the Phase I. After the IVM, all oocytes were submitted to in vitro fertilization (IVF) for 18 h, and subsequent in vitro embryo culture for 48 h. On day 3-post IVF, all presumptive zygotes were surgically transferred into the oviduct of 3 recipients. Thirty-six days later, a transrectal ultrasonography was performed for pregnancy diagnosis. Follicle morphology, oocyte diameter, fertilization and embryo production were evaluated. In the Phase I, PAFs and EAFs behaved differently under the same culture conditions. The GH treatment for EAFs presented the highest (P < 0.05) mean oocyte diameter (117.74 m) and meiotic maturation (42.5%). In the Phase II, individual IVM system did not negatively affect oocyte nuclear maturation. The IVFC-18 treatment produced higher (P < 0.05) MII oocytes (46.2%) and oocyte diameter (119 m). Moreover, follicles with a daily growth > 7.1 m, and that reached at least 600 m in diameter, were more likely (P < 0.05) to produce meiotically competent oocytes. Finally, in Phase III, linseed did not affect goat in vitro folliculogenesis, but it increased (P < 0.05) the recovery rate of oocytes 110 m, and negatively affected (P < 0.05) the sperm penetration rate, even though with no further effect on the cleavage rate.

Biblioteca responsável: BR68.1