EXPRESSÃO GÊNICA DE CITOCINAS NO ENDOMÉTRIO BOVINO PRÉ-SENSIBILIZADO COM ANTÍGENOS MATERNOS E PATERNOS E NA INFLAMAÇÃO SUBCLÍNICA

RESUMO

Infecções uterinas logo após o parto e perdas embrionárias relacionadas a falhas na imunotolerância ao concepto no início da gestação são importantes causas de baixa eficiência reprodutiva na bovinocultura. No presente estudo objetivou-se comparar a expressão dos genes CCL5, IL-8, IL-6 e IL-1 na mucosa endometrial com e sem inflamação, em regiões caruncular e intercaruncular, utilizando os métodos de coleta biopsia e cytobrush endometriais. Vinte úteros foram inseridos no experimento após avaliação da porcentagem de células polimorfonucleares (PMNs) na citologia endometrial, sendo dez sem a presença de PMNs (inflamação endometrial ausente), sete com PMNs variando entre 11 e 19% (inflamação endometrial leve) e três com PMNs entre 75 e 81% (inflamação endometrial grave). Após a coleta das amostras, foi feita a extração dos RNAs, em seguida realizada a transcrição reversa e a reação de qPCR para a quantificação da expressão gênica. Não foi observada diferença na expressão gênica entre as regiões carunculares e intercarunculares e a expressão foi dependente do grau de inflamação. Inflamações leves não apresentaram diferenças significativas em relação aos úteros não inflamados, existindo diferença apenas nas inflamações graves, tanto em amostras por biopsia como cytobrush. Houve influência da técnica de coleta de endométrio na expressão gênica somente na inflamação grave, sendo os melhores resultados observados em amostras colhidas por cytobrush. Este trabalho também teve como objetivo compreender os mecanismos da imunotolerância uterina ao concepto por meio de análise da expressão dos genes IL-1, IL-2, IL-6, IL-17, IFNG e LIF, e o perfil destes durante o início da gestação. Foram utilizadas 45 vacas sincronizadas ao estro, submetidas à indução imunológica intrauterina, administrada no D0 (dia do estro), sendo quatro tratamentos sêmen, PBMCs (células mononucleares de sangue periférico), sêmen e PBMCs e controle (sem indução). As biópsias uterinas in vivo foram coletadas em três momentos, D0 (sem indução imunológica) e dia sete (D7) e 14 (D14) após a estimulação imunológica. Após a indução imunológica, a expressão de RNAm do gene IL-1 reduziu significativamente em todos os grupos sensibilizados em comparação ao controle. O gene IL-2 apresentou maior expressão somente na indução com sêmen. Observou-se também que a expressão dos genes IL-1 e IL-2 variaram significativamente entre D0, D7 e D14 do ciclo estral. O gene IL-6 não apresentou variações de expressão entre as induções imunológicas e nem durante os primeiros 14 dias do ciclo estral. O resultados dos genes IL-17, IFNG e LIF foram inconclusivos. Conclui-se que a identificação de inflamações uterinas por meio de expressão gênica só foi possível nos casos graves, sendo os melhores resultados observados em amostras colhidas por cytobrush. E que a expressão dos genes IL-1 e IL-2 podem ser modulados por imunoindução, sugerindo que a sensibilização imunológica pode contribuir com o sucesso da gestação.

ABSTRACT

Uterine infections soon after delivery and embryonic losses related to failures in the immunotolerance to the concept at the beginning of gestation are important causes of low reproductive efficiency in bovine breeding. The aim of this study was to compare the expression of the CCL5, IL-8, IL-6 and IL-1 genes in the endometrial mucosa with and without inflammation in the caruncular and intercaruncular regions using endometrial biopsy and cytobrush collection methods. Twenty uteri were used in the experiment after evaluation of the percentage of polymorphonuclear cells (PMNs) in endometrial cytology, being ten without PMNs, seven with PMNs ranging from 11 to 19% (soft endometrial inflammation) and three with PMNs between 75 and 81% (severe endometrial inflammation). These samples were collected, its RNAs were extracted, and then the reverse transcription and the qPCR reaction were performed for the quantification of the gene expression. No difference was observed in the gene expression between the caruncular and intercaruncular regions and the expression was dependent on the degree of inflammation. Soft inflammations did not present significant differences in comparison to uninflamed uteri. On the other hand, severe inflammation presented difference in comparison to the control group, independent of the collection method, biopsy or cytobrush. The influence of the endometrial collection technique in the gene expression was observed only in the severe inflammation, and the best results were observed in samples collected by cytobrush. This study had also the objective to understand the mechanisms of uterine immunotolerance to the concept by analyzing the IL-1, IL-2, IL-6, IL-17, IFNG and LIF gene expression during the early gestation. Forty-five cows synchronized to estrus were submitted to intrauterine immunological induction, administered in D0 (estrus day), with four treatments semen, PBMCs, semen and PBMCs and control (without induction). In vivo uterine biopsies were collected at three different times the first at D0 (no immunological induction), the second at day seven (D7) and the final one at day 14 (D14) after immunological stimulation. After immunological induction, IL-1 mRNA expression was significantly reduced in all sensitized groups when compared to control. The IL-2 gene presented greater expression only in semen induction. It was likewise observed that IL-1 and IL-2 gene expression varied significantly between D0, D7 and D14 of the estrous cycle. The IL-6 gene did not show expression variations from the immunological inductions nor during the first 14 days of the estrous cycle. The results of the IL-17, IFNG and LIF genes were inconclusive. It was concluded that the identification of uterine inflammation through gene expression is only possible in severe cases, and the best results are observed in samples collected by cytobrush. In addition, the IL-1 and IL-2 gene expression can be modulated by immune-induction, suggesting that immunological sensitization may contribute to the success of gestation.