MICRO-ORGANISMOS DETERIORANTES DO LEITE: ATIVIDADE PROTEOLÍTICA E LIPOLÍTICA DE BACTÉRIAS PSICROTRÓFICAS E TERMODÚRICAS MESÓFILAS

RESUMO

A presença de enzimas microbianas deteriorantes termoestáveis proteolíticas e lipolíticas pode comprometer a qualidade e vida útil do leite processado e derivados, mesmo que o leite cru apresente baixas contagens totais de micro-organismos. Além disso, as formas microbianas vegetativas ou esporuladas podem resistir à pasteurização e também atuarem como deteriorantes do leite pasteurizado. Como passo preliminar para redução dos micro-organismos deteriorantes no leite cru refrigerado, aumento da vida útil e do potencial tecnológico do leite pasteurizado, o presente trabalho teve como objetivo identificar a diversidade genética de micro-organismos psicrotróficos e termodúricos com potencial deteriorante proteolítico e/ou lipolítico no leite cru refrigerado de alta qualidade microbiológica. Foram avaliadas 20 amostras de leite cru refrigerado produzido na bacia leiteira da região de Castro, Paraná, nas quais foram utilizados métodos oficiais para a contagem e isolamento de psicrotróficos e termodúricos e técnicas biomoleculares de agrupamento genético hierárquico (Restriction Fragment Length Polymorphism) e caracterização (sequenciamento parcial do gene 16S rRNA e análise filogenética) dos isolados. As contagens médias de psicrotróficos e termodúricos foram 1,1 x 104 e 3,2 x 102 UFC/mL, respectivamente. Entre os psicrotróficos, 47,8% do total de isolados (n = 295) apresentaram atividade deteriorante, dos quais 30,5% foram proteolíticos e lipolíticos simultaneamente, 31,9% exclusivamente proteolíticos e 37,6% lipolíticos. Pelos dendrogramas foram determinados 36 clusters de psicrotróficos proteolíticos e 47 de lipolíticos com 70% de similaridade hierárquica, cuja identificação filogenética determinou o predomínio das espécies com os mesmos perfis polimórficos de Lactococcus lactis (24,5%), Enterobacter kobei (15,4%), Aerococcus urinaeequi (8,4%) e Acinetobacter lwoffii (6,3%) entre os psicrotróficos deteriorantes. Serratia ureilytica, Enterobacter kobei, Pseudomonas spp. e Yersinia enterocolitica foram os psicrotróficos identificados como potencialmente produtores de metaloprotease alcalina (aprX). Entre os termodúricos, 42,6% do total de isolados (n = 310) foram deteriorantes, dos quais 32,6% apresentaram atividade proteolítica e lipolítica simultaneamente, 31% exclusivamente proteolítica e 36,4% apenas lipolítica. Esses isolados proteolíticos e lipolíticos foram agrupados em 41 e 38 clusters, respectivamente, considerando 50% de similaridade. A análise filogenética das sequências parciais do gene 16S rRNA revelou que predominam entre os termodúricos deteriorantes as espécies Bacillus licheniformis (34,1%), Brachybacterium nesterenkovii (14,4%), Enterococcus faecalis (9,1%) e Streptococcus agalactiae (8,3%). Foi observado que 50% das cepas de termodúricos pertencem aos gêneros Bacillus e Paenibacillus, frequentemente descritos como esporulados que resistem a tratamentos térmicos mais intensos que a pasteurização e que comprometem a vida útil do leite pasteurizado dos Estados Unidos. Os resultados do presente trabalho demonstram que a composição da microbiota é tão importante quanto a sua quantificação. Apesar de baixas contagens, psicrotróficos e termodúricos podem comprometer a qualidade do leite e derivados pela sua atividade deteriorante, sendo um fator limitante na manutenção da qualidade do leite fluido e derivados. Portanto, é necessário desenvolver ferramentas sensíveis e eficientes para monitorar e controlar a presença desses micro-organismos no leite cru.

ABSTRACT

The presence of heat-stable spoilage enzymes can compromise the milk and dairy products quality and shelf life, even if raw milk with low total microorganisms counts. In addition, the vegetative or sporulated microbial forms may resist pasteurization and also deteriorate pasteurized milk. The present work aimed to identify the genetic diversity of psychrotrophic and thermoduric microorganisms with proteolytic and/or lipolytic potential in high microbiological quality refrigerated raw milk. Twenty samples of refrigerated raw milk produced in the dairy region of Castro, Paraná State, Brazil, were evaluated per official methods for the counting and isolation of psychrotrophic and thermoduric. Biomolecular techniques of hierarchical genetic grouping (Restriction Fragment Length Polymorphism) and identification by partial sequencing of the 16S rRNA gene and phylogenetic analysis. The mean of psychrotrophic and thermoduric counts were 1.1 x 104 and 3.2 x 102 CFU/mL, respectively. Among the psychrotrophs, 47.8% of the total isolates (n = 295) presented spoilage potential, of which 30.5% were proteolytic and lipolytic simultaneously, 31.9% exclusively proteolytic and 37.6% lipolytic. The dendrograms determined 36 clusters of proteolytic and 47 lipolytic psychrotrophs with 70% genetic hierarchical similarity, whose phylogenetic identification shows the predominance of the species with the same polymorphic profiles of Lactococcus lactis (24.5%), Enterobacter kobei (15.4%), Aerococcus urinaeequi (8.4%) and Acinetobacter lwoffii (6.3%) among the deteriorating psychrotrophs. Serratia ureilytica, Enterobacter kobei, Pseudomonas spp. and Yersinia enterocolitica were the psychrotrophs identified as potentially producing of alkaline metalloprotease (aprX gene positive). Among the thermoduric, 42.6% of the total isolates (n = 310) shows spoilage potential, of which 32.6% presented proteolytic and lipolytic activity simultaneously, 31% were exclusively proteolytic and 36.4% only lipolytic. These proteolytic and lipolytic isolates were grouped in 41 and 38 clusters, respectively, considering 50% of genetic similarity. Phylogenetic analysis of partial sequences of 16S rRNA gene revealed that Bacillus licheniformis (34.1%), Brachybacterium nesterenkovii (14.4%), Enterococcus faecalis (9.1%) and Streptococcus agalactiae (8.3%). It was observed that 50% of the thermoduric strains belong to the genus Bacillus and Paenibacillus, often described as sporulated that resist heat treatments that are more intense at pasteurization and that compromise the shelf life of the pasteurized milk in the United States. The results of the present study demonstrate that the microbiota composition of raw milk as so important that your quantification. Although low counts, psychrotrophic and thermoduric can compromise the milk quality and dairy produtcs by their deteriorating activity, being a limiting factor for the maintenance of the quality. Therefore, it is necessary to development of a sensitive and efficient tools to monitor and control the presence of these microorganisms in raw milk.