ENVOLVIMENTO DO ESTRESSE OXIDATIVO E DO INFILTRADO LINFOCÍTICO NO MICROAMBIENTE TUMORAL MAMÁRIO EM CADELAS

RESUMO

O câncer de mama é a principal neoplasia diagnosticada em mulheres e cadelas. No entanto, a etiologia do tumor mamário canino (TMC) ainda não está esclarecida. Este trabalho teve como objetivos investigar o nível sérico de oxidantes e antioxidantes não enzimáticos, estudar o infiltrado celular (IC) e infiltrado linfocítico tumoral (TIL), além da expressão de biomarcadores no microambiente tumoral, bem como a associação de características clínico-patológicas e tempo de sobrevivência das cadelas. Para tanto, as cadelas foram divididas no grupo com TMC benigno (Be), TMC maligno (Ma) e animais controles (Co). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA-UECE), número 12247080-2. Os níveis séricos de proteína total, globulina, bilirrubina e malondialdeído (MDA) foram maiores (P < 0,05) nos grupos Ma e Be comparado ao grupo Co. Todas as características malignas apresentaram níveis elevados de MDA e estavam associados com necrose e tipo de tumor (P < 0,05). Não foi observada associação entre o MDA e o tempo de sobrevida geral. A idade média dos animais foi de 9,3 anos, os tumores estavam localizados nas regiões inguinais e predomínio de grau I-II do TMC. IC estava distribuído nas regiões peri e intratumoral, tendo linfócitos como principal população encontrada dentro dos tumores. A correlação do IC com o grau do TMC demostrou que os linfócitos ( = 0,28) e as células plasmáticas ( = 0,22) apresentaram uma ligeira correlação positiva, por outro lado, neutrófilos ( = -0,1) e macrófagos ( = -0,38) apresentaram correlação negativa. Cadelas com TIL moderado (< 800 linfócitos) TMC apresentaram maior taxa de sobrevivência (P = 0,01) em relação aos animais com infiltrado linfocítico intenso ( 800 linfócitos). Foram observados linfócitos FoxP3 em menor intensidade enquanto que CD4 e CD8 estava em maior quantidade e concentrada no TIL. HSP60 foi observado nas células inflamatórias e tumorais. No estroma tumoral pode-se observar que 65,2% dos tumores apresentavam baixo TIL e tumores com alto TIL diferiu significativamente (P < 0,001) em relação ao baixo TIL. O TIL estromal foi associado (P < 0,009) a expressão de PD-L1 (39%) no TMC. Nas metástases dos linfonodos (n = 5), PD-L1 estava presente no epitélio maligno e estava associado (P < 0,034) ao envolvimento de linfonodos regionais. As curvas de sobrevivência demonstraram maior sobrevida nos animais com baixo TIL (P < 0,01) comparado ao com auto TIL. As variáveis clínico-patológicas correlacionadas com sobrevida global por análise univariada foram grau de tumor (P < 0,009), envolvimento dos linfonodos (P < 0,004), TIL (P < 0,016) e PD-L1+/auto TIL vs. PD -L1-/baixo TIL (P <0,01). A análise multivariada revelou que o grupo de tumores com grau II-III era um fator independente e pior prognósticos para a sobrevida global. Conclui-se que os TMC apresentam intensa peroxidação lipídica, presença de CD4, CD8 e FoxP3 nas regiões peri e intratumoral e a expressão de PD-L1 está associada com TIL estromal. Estes marcadores podem estar relacionados ao prognóstico dos tumores mamários caninos e podem ser utilizados como alvos para terapias anticâncer.

ABSTRACT

Breast cancer is the major neoplastic diagnosticated in both dogs and human. However, canine mammary tumor (CMT) etiology still unknown. This study investigates the serum levels of oxidant and antioxidant non-enzymatic, cell infiltrate (CI) and tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), and tumor microenvironment biomarker expressions, as well as the association of clinic-pathological features and survival time of animals. Female dogs were divided into benign (Be) CMT, malignant (Ma) CMT, and healthy control dogs (Co). This study was approved by the Committee for Ethics in Research using Animals (CEUA-UECE), protocol 12247080-2. The levels of total proteins, globulin, bilirubin and MDA was higher (P < 0.05) in Ma and Be CMT than Co group. All malignancy features present high MDA levels, and the parameters as necrosis and type of tumor had difference (P < 0.05) between categories. No association was observed between MDA and overall survival (OS). Data showed a mean age of 9.3 years old, tumors were located in inguinal mammary glands, and CMTs shows I-II grade. CI was distributed both in peri and intratumoral regions, and lymphocytes cells were the major populations into tumors. In relationship to CI with CMT grade it was observed that lymphocytes ( = 0.28) and plasma cells ( = 0.22) showed a slight positive correlation, and an opposed negative correlation of neutrophil ( = -0.1) and macrophage ( = -0.38). CMT presents moderate lymphocytic infiltrate (< 800 lymphocytes), shows higher (P = 0.01) survival rates as compared to intense lymphocytic infiltrate ( 800 lymphocytes). FoxP3 showed lower intensity while CD4 and CD8 lymphocytes expression was higher and concentrated within TIL. HSP60 was observed in the inflammatory and tumor cells. TILs evaluation within tumor stroma revealed that 65.2% had TILs-Low, and TILs-High differed (P < 0.001) from TILs-Low. PD-L1 and stromal TILs were associated (P < 0.009). Immunostaining of PD-L1 (39%) in TILs has shown strong labeled in lymphocytes within tumor stroma. PD-L1 in malignant epithelium was present in all lymph node metastasis (n = 5), and was associated with regional lymph nodes involvement (P < 0.034). Survival curves demonstrated difference between TILs-Low and TILs-High (P < 0.01). The clinic-pathologic variables significantly correlated with OS by univariate analysis were grade of tumor (P < 0.009), lymph node involvement (P < 0.004), stromal TILs (P < 0.016), and PD-L1+/TILs-High vs. PD-L1/TILs-Low (P < 0.01). Multivariate analysis revealed that group of tumors with grade II-III was independent and negative prognostic factors for OS. We concluded that MDA support the lipid peroxidation in MGT-bearing dogs. CD4, CD8 and FoxP3 labeling were distributed in peri and intratumoral regions. PD-L1 expression was associated with stromal TILs. These markers may represent important survival prognostic biomarkers for canine mammary tumors and can be used as potential target for anticancer therapies.