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PEPTÍDEOS DE PENETRAÇÃO CELULAR EM TRANSGÊNESE ANIMAL: PERSPECTIVA DE USO DA CROTAMINA EM EMBRIÕES BOVINOS

IANA SALES CAMPELO.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-208164

Resumo

Em transgênese animal, diversos métodos já foram utilizados para a obtenção de crias, contudo todos eles apresentam baixa eficiência. Por isso, novas metodologias vêm sendo desenvolvidas. Nesse contexto, os peptídeos de penetração celular (PPCs) já foram testados como carreadores de DNA exógeno. A crotamina, um desses PPCs, é uma molécula obtida a partir do veneno de cascavel (Crotalus durissus terrificus) e possui a capacidade de interagir estavelmente a ácidos nucleicos por interação eletrostática (formando um complexo peptídeo-DNA). Assim, objetivo desse estudo foi verificar o potencial uso da crotamina, nas formas nativa e linear, como molécula carreadora de DNA exógeno para a produção de embriões bovinos transgênicos. Para tanto, foram realizados dois estudos. No primeiro, embriões foram expostos à crotamina nativa por diferentes intervalos de tempo para avaliar a sua penetração. Além disso, embriões fecundados in vitro (FIV) foram expostos ou microinjetados com complexo formado por crotamina nativa e DNA repórter para avaliação da transfecção. Quanto à penetração, imagens de microscopia confocal revelaram que a crotamina nativa foi captada pelos embriões após 1 h de exposição. Em relação à transfecção, a exposição e a microinjeção no espaço de perivitelino com complexo crotamina nativa-DNA não resultaram em embriões expressando o transgene, enquanto que a injeção intracitoplasmática de DNA apresentou taxas de expressão maiores do que a injeção intracitoplasmática de complexo crotamina nativa-DNA. Já no segundo estudo, inicialmente foi avaliada a capacidade da crotamina linear de complexar DNA em diferentes condições, usando crotamina nativa e lipofectamina como controles. Além disso, testamos a embriotoxicidade da crotamina linear expondo embriões bovinos FIV a diferentes concentrações do peptídeo por 6 h. Para avaliar a eficácia da crotamina linear em induzir a expressão de DNA exógeno, o complexo crotamina linear-DNA foi microinjetado em zigotos pós-FIV. Quanto à complexação, o complexo crotamina linear-DNA atingiu eficiências semelhantes nas proporções 1:100 e 1:50 (DNA: peptídeo) e a complexação foi maior do que os controles para esses grupos. Por isso, testamos proporções até 1:50 em diferentes intervalos de tempo. A complexação ocorreu muito rápido, pois pelo menos metade da complexação final (medida a 90 min) foi alcançada dentro dos 30 primeiros minutos para todos os grupos. Em relação à embriotoxicidade, todos os parâmetros de desenvolvimento embrionário registrados foram semelhantes comparados a embriões não-expostos. Assim, a exposição de zigotos não teve efeito sobre o desenvolvimento in vitro. Quanto à transfecção, ao utilizar o complexo crotamina linear-DNA não houve aumento na eficiência de produção de embriões expressando o gene repórter quando comparado com embriões microinjetados apenas com DNA. Desta forma, conclui-se que a crotamina nativa é capaz de translocar através da zona pelúcida de embriões bovinos. Por sua vez, a crotamina linear efetivamente forma um complexo com DNA sem apresentar embriotoxicidade detectável nas condições testadas. Provavelmente devido à elevada estabilidade de complexação entre as moléculas de DNA e esses peptídeos, o uso da crotamina tanto nativa quanto linear não melhorou a expressão de DNA exógeno em embriões bovinos.
For animal transgenesis, several methods have been used to obtain offspring, however all of them have low efficiency. Therefore, new methodologies have been developed. In this scenario, cell penetrating peptides (CPPs) have already been tested as carriers of exogenous DNA. Crotamine, one of these CPPs, is a molecule obtained from the venom of rattlesnakes (Crotalus durissus terrificus) and has the ability to stably interact with nucleic acids by electrostatic interaction (forming a peptide-DNA complex). Therefore, the aim of this study was to verify the potential use of crotamine, in its native and linear forms, as exogenous DNA carrier molecule for the production of transgenic bovine embryos. For this, two studies were performed. In the first, embryos were exposed to native crotamine for different time intervals to evaluate its penetration. In addition, in vitro fertilized (IVF) embryos were exposed or microinjected with complex formed by native crotamine and reporter DNA for transfection evaluation. Concerning to penetration, images from confocal microscopy revealed that native crotamine was taken up by the embryos after 1 h of exposure. Regarding transfection, exposure and microinjection in the periviteline space with native crotamine-DNA complex did not result in embryos expressing the transgene, whereas the intracytoplasmic DNA injection had higher rates of expression than intracytoplasmic native crotamine-DNA complex injection. In the second study, initially it was evaluated linear crotamine ability to complex DNA under different conditions, using native crotamine and lipofectamine as controls. Besides, we tested the embryotoxicity of linear crotamine by exposing bovine IVF embryos at different peptide concentrations for 6 h. To evaluate the efficacy of linear crotamine in inducing exogenous DNA expression, the linear crotamine-DNA complex was microinjected into post-IVF zygotes. For complexation, the linear crotamine-DNA complex reached similar efficiencies at proportions 1:100 and 1:50 (DNA: peptide) and complexation was higher than controls for these groups. Therefore, we tested proportions up to 1:50 at different time intervals. Complexation occured very fast, since at least half of the final complexation (measured at 90 min) was achieved within initial 30 minutes for all groups. Regarding embryotoxicity, all embryonic development parameters recorded were similar compared to non-exposed embryos. Thus, zygote exposure had no effect on in vitro development. Regarding transfection, when using linear crotamine-DNA complex there is no increase in the efficiency of embryos expressing the reporter gene when compared to embryos microinjected with DNA alone. In this way, it is concluded that crotamine is able to translocate through the zona pellucida of bovine embryos. In turn, linear crotamine effectively forms a complex with DNA in the absence of detectable embryotoxicity under the tested conditions. Likely due to the high stability of complexation between the DNA molecules and these peptides, the use of both native and linear crotamine did not improve the expression of exogenous DNA in bovine embryos.
Biblioteca responsável: BR68.1