AVALIAÇÃO DE ANTÍGENOS BASEADOS NOS RECEPTORES DE TRANSFERRINA PARA A PREVENÇÃO DA DOENÇA DE GLÄSSER EM SUÍNOS

RESUMO

Haemophilus parasuis é o agente causador da Doença de Glässer (GD), uma das mais importantes doenças bacterianas que acomete suínos mundialmente. A DG é observada principalmente na fase de creche, produzindo importantes perdas econômicas na cadeia produtiva de suínos em razão da mortalidade e do alto custo do tratamento dos animais acometidos. Atualmente o principal método de prevenção da GD é a vacinação. No entanto, o uso de vacinas comerciais tem sido intensamente questionado devido aos inúmeros surtos de GD, convertendo a investigação de novas formulações vacinais uma prioridade para esta doença. Nesta dissertação aportamos novos conhecimentos sobre as propriedades imunológicas de antígenos recombinantes derivados das Proteínas de União à Transferrina A e B (TbpA e TbpB) de Haemophilus parasuis. A capacidade de proteção de quatro antígenos recombinantes e de duas bacterinas foi avaliada utilizando um modelo suíno altamente susceptível e infectado com H. parasuis, SV7, cepa 174. Entre os antígenos recombinantes, avaliamos duas versões da proteína TbpB com mutagênese dirigida e defectivas na união à transferrina e dois antígenos híbridos, os quais apresentavam na superfície da TbpB loops da proteína TbpA. As proteínas TbpBs mutantes possuem uma substituição de um aminoácido aromático na superfície do lóbulo N [lisina (Y) e triptofano (W)] por uma alanina (A). A versão Y167A TbpB e W176A TbpB tiveram um resíduo de tirosina e triptofano, substituído por uma alanina nas posições indicadas, respectivamente. A perda da capacidade de união, a qual pode ser se confirmada através de um ensaio do tipo Dot Assay utilizando transferrina suína conjugada com peroxidase, é atrativa porque previne que a transferrina seja capturada pela TbpB durante o processo de imunização, expondo ao sistema imune importantes epítopos presentes na região de união à transferrina da TbpB. Os antígenos híbridos foram desenhados mediante a inserção do loop 10 exposto na superfície da TbpA na estrutura da proteína TbpB. O antígeno Nm LCL + Hps TbpA loop 10 é constituído pelo loop 10 da TbpA de H. parasuis inserida no lóbulo C - LCL da TbpB de Neisseria meningitides, strain M982. O lóbulo C - LCL foi molecularmente alterado, tendo seus longos loops superficiais removidos e servindo como local para a inserção de antígenos exógenos. A proteína Y167A + Nm TbpA loop 10 consta da proteína Y167A TbpB intacta contendo o loop 10 da TbpA de N. meningitides na superfície da estrutura do lóbulo C. A construção dos antígenos híbridos, nos permitiu determinar se as imunizações baseadas em um único loop da TbpA poderiam prevenir a DG e se a inserção de um loop na superfície da proteína TbpB intacta poderia impactar na resposta imune gerada contra as versões híbridas em comparação com as versões da TbpB intacta. Finalmente, duas bacterinas (células inteiras inativadas quimicamente) baseadas na cepa clínica de H. parasuis 41.2015 (SV5) foram também preparadas. As vacinas de subunidades foram formuladas com 200µg de antígeno/dose e as bacterinas com 1×109 and 5×109 células/dose, todas contendo 15% (v/v) de adjuvante Montanide Gel 01. Trinta e três suínos privados de colostro foram divididos em 7 grupos Y167A TbpB (n=5), W176A (n=5), Nm LCL + Hps TbpA loop 10 (n=5), Y167A + Nm TbpA loop 10 (n=5), bacterinas (n=4/cada) e grupo controle imunizado com PBS acrescido de adjuvante (n=5). Com o objetivo de avaliar a capacidade protetora destes antígenos, suínos foram vacinados 2 vezes (dia 0 e 21) e 14 dias após a segunda imunização os animais foram desafiados pela via intra-traqueal com 1×107 células de H. parasuis, cepa 174. A cinética da resposta imune humoral foi avaliada com amostras de sangue coletadas nos dias 0, 14, 21, 28 e 35, e a titulação de IgGs totais foi realizada com as amostras coletadas no dia 35. Nossos resultados demonstraram que os antígenos W176A e Y167A + Nm TbpA loop 10 induzem uma baixa resposta de IgG após a primeira vacinação (dia 21), no entanto, todas as vacinas estimulam níveis altos de IgG nos dias 28 e 35. Curiosamente o título de IgG induzido pelo antígeno Y167A TbpB foi significativamente superior ao induzido pela versão W176A TbpB. A capacidade das IgGs específicas de reconhecerem a cepa utilizada no desafio foi avaliada por citometria de fluxo. Com exceção do antígeno Nm LCL + Hps TbpA loop 10, todos os demais demonstraram alta capacidade de reconhecimento da cepa 174 de Hps, sendo este reconhecimento maior inclusive que a resposta advertida nas bacterinas. Também, observamos que IgGs induzidas por todas as formulações vacinais eram capazes de ativar a via clássica do sistema do complemento contra a cepa de desafio e contra os antígenos vacinais, exceto as IgGs derivadas do antígeno Nm LCL + Hps TbpA loop 10, as quais não eram capazes de ativar contra a cepa de desafio. Após cada uma das duas doses vacinais todas as formulações estimularam o aumento do número de linfócitos T CD4+ e B-IgM+ circulantes. E, com relação a capacidade de proteção das vacinas após o desafio experimental, observamos 80% (4/5) de sobrevivência no grupo imunizados com a proteína Y167A TbpB e 60% de sobrevivência no grupo imunizados com a versão Y167A + Nm TbpA loop 10. Todos os demais animais morreram após o desafiado ou foram humanamente eutanasiados. Em síntese, neste estudo demonstramos 1) Y167A TbpB induz proteção heteróloga frente ao desafio com a cepa 174 de H. parasuis; 2) A cepa 174 (SV7) deve ser reclassificada como altamente virulenta; 3) Bacterinas baseadas no SV5 de H. parasuis não previnem contra a doença causada pelo SV7; e por fim, a utilização da tecnologia de engenharia estrutural de proteínas propiciou o desenvolvimento de um antígeno promissor (Y167A) e com características imunológicas melhoradas, sendo um bom presságio do desenvolvimento de uma vacina de amplo espectro contra todos os sorovares de H. parasuis.

ABSTRACT

Haemophilus parasuis (Hps) is the causative agent of the Glässers disease (GD), one of the most important bacterial diseases of swine worldwide. The disease is observed mainly in the nursery phase of production, leading to important economic losses for the pig industry due to mortality and the expensive treatment of sick animals. Currently, the primary method for GD prevention is vaccination. However, the use of commercial vaccines has been unable to prevent many global outbreaks of GD prompting us to investigate better vaccine design strategies. In this thesis, we provide new insights about immunological properties of engineered antigens based on transferring binding protein A and B (TbpA and TbpB) of Haemophilus parasuis. The protection capacity of four recombinant antigens and two bacterins were evaluated in a highly susceptible pig model experimentally infected by H. parasuis, SV7, 174 strain. The recombinant antigens were composed of two site directed non transferrin binding TbpB mutant proteins and two hybrid antigens where surface exposed loops of TbpA were displayed on a TbpB based scaffold. The non-binding TbpB mutants were designed by substituting an aromatic residue on the binding surface of the TbpB N-lobe to an alanine residue. Y167A TbpB and W176A TbpB had a tyrosine and tryptophan residue, respectively, substituted to an alanine residue at the indicated position. The loss of binding, which can be confirmed using a simple dot assay with HRP conjugated to porcine transferrin, is attractive because it prevents the antigen binding to transferrin upon immunization and exposes the binding region of the TbpB to the immune system as important epitopes. Two hybrid antigens were designed by selecting the surface exposed loop 10 of TbpA and inserting the loop into TbpB based scaffold. The Nm LCL + Hps TbpA Loop 10 has the TbpA Loop 10 of H. parasuis inserted on the loopless C-lobe (LCL) of the TbpB of Neisseria meningitides, strain M982.The loopless C lobe was designed by removing large loops that did not resolve in the crystal structure of the C lobe, suggesting that large flexible loops can be accommodated in that region. The Y167A + Nm TbpA Loop 10 is composed of the intact TbpB Y167A with a Loop 10 of the N. meningitides TbpA inserted into its C-lobe structure. This strategy enabled us to determine whether immunizations with a single loop of TbpA can prevent disease and whether insertion of a loop into the intact TbpB protein impacted the immune response generated against the hybrid compared to the TbpB alone. Finally, two bacterins (whole cells chemically inactivated) based on Hps (SV5) field strain 41.2015 were also prepared. All subunit vaccines were formulated with 200 µg of antigen/dose and the bacterins with 1×109 and 5×109 whole cell/dose, mixing with 15% (v/v) of Montanide Gel 01 adjuvant. Thirty-three colostrum deprived pigs were divided into 7 groups, 4 groups of 5 animals for the recombinant antigens, 2 groups of 4 animals for two bacterins, and 5 animals as control, which were inoculated with sterile PBS plus adjuvant. In order to evaluate the protective capacity of the antigens, pigs were vaccinated 2 times (days 0 and 21), and 14 days after the second immunization the animals were challenged intratracheally with 107 cells of the H. parasuis 174 strain. The kinetics of the immune response were evaluated with blood samples collected on days 0, 14, 21, 28 and 35, and titration of antibodies was performed on day 35. Although the antigens W176A and Y167A + Nm TbpA Loop 10 antigens induced a low IgG response after first immunization (at day 21) compared to the other antigens, all vaccines stimulated maximum response on days 28 and 35. Curiously, the titre of IgGs induced by Y167A TbpB was significantly higher than those observed in the animals immunized with W176A TbpB. The ability of induced IgGs to recognize the challenge strain was conducted by flow cytometry. Apart from Nm LCL + Hps TbpA Loop 10 antigen, all another 3 recombinant antigens induced IgGs with high capacity to detect live Hps 174 strain, even higher than those induced by bacterins. In addition, all IgG induced were able to activate the classical pathway of the complement system against the immunizing antigens and challenge strain, except for Nm LCL + Hps TbpA Loop 10 antigen against the latter. All vaccines stimulated an increase in the percentage of T CD4+ and B -IgM+ lymphocytes after the first and second immunizations. Regarding to the protection capacity conferred by vaccines after challenge, we observed 80% (4/5) survival in the group immunized with the Y167A TbpB protein and 60% survival in the group immunized with the hybrid antigen Y167A + Nm TbpA loop 10. All other animals died or were humanely euthanized after the challenge. In this study, we demonstrated 1) Y167A TbpB can induce heterologous protection against Hps SV7; 2) The Hps174 reference strain (SV7) needs to be reclassified as a high virulent strain; 3) Bacterin based on Hps SV5 cannot to prevent the disease caused by SV7; and finally, the structure-based protein engineering approach has produced a promising antigen (Y167A) with improved immunological properties that bodes well for developing a cross-protective vaccine against all serovars of H. parasuis.