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Tese em Inglês | VETTESES | ID: vtt-208285

Resumo

A homeostase tecidual é controlada por uma série de mecanismos de comunicação. Ao nível intercelular, as junções gap permitem o tráfego de mensageiros pequenos e hidrofílicos, menores do que 1.5 kilodalton, entre duas células adjacentes. As junções gap são formadas por dois hemicanais, que por sua vez são compostos por seis proteínas denominadas conexinas (Cx). No fígado, os hepatócitos produzem principalmente Cx32, enquanto as células hepáticas não parenquimatosas contem predominantemente Cx43. As junções gap hepáticas são conhecidas por serem essenciais em diversas funções específicas do fígado, tais como secreção de albumina e metabolismo de xenobióticos. Na última década, tem-se tornado claro que os hemicanais de conexinas não são apenas precursores das junções gap, mas eles também podem participar da via de comunicação, contudo entre o citoplasma de células individuais e seus ambientes extracelulares. Além disso, foi descrita uma nova classe de proteínas semelhantes às conexinas, as panexinas (Panx), das quais a Panx1 é expressa no fígado. As pannexins se reúnem em uma configuração que lembra os hemicanais de conexinas e também participam da sinalização extracelular. Acredita-se que tanto os hemicanais de conexinas como os canais de pannexinas se tornam ativados preferencialmente em condições patológicas e, deste modo, promovam a morte celular e inflamação. O presente projeto de doutorado foi estabelecido para verificar se esta hipótese também é verdadeira nas doenças hepáticas, em particular na insuficiência hepática aguda. Inicialmente, o padrão de expressão das conexinas hepáticas foi totalmente caracterizado em um modelo murino de insuficiência hepática aguda induzida pelo paracetamol (APAP). Isto revelou uma mudança da Cx32 para Cx43 após a hepatotoxicidade induzida por APAP, com expressão de novo de Cx43 nos hepatócitos. Subsequentemente, a relevância funcional da expressão aumentada de Cx43 na insuficiência hepática aguda foi testada utilizando camundongos deficientes em Cx43. Verificou-se que a Cx43 tem um efeito protetor, uma vez que a lesão hepática induzida por APAP se agravou após a ablação genética da Cx43. Em paralelo, foi realizado um estudo semelhante utilizando camundongos knockout para Cx32, não mostrando diferenças significativas na extensão da hepatotoxicidade induzida pelo APAP em comparação aos animais selvagens. Uma vez que os animais deficientes em conexina não permitem diferenciar entre a comunicação via junções gap e a sinalização pelos hemicanais de conexina, uma série de experimentos seguintes baseou-se na utilização de inibidores dos hemicanais de Cx32 e Cx43, chamados de TAT-Gap24 e TAT-Gap19, respectivamente. Após os testes in vitro quanto a sua especificidade e eficiência in vitro, ambos os peptídeos foram administrados em camundongos com overdose pelo APAP. Enquanto TAT-Gap24 reduziu claramente a morte celular e inflamação, TAT-Gap19 apresentou apenas efeitos discretos sobre a lesão hepática. Além disso, o co-tratamento 12 de camundongos intoxicados pelo APAP com ambos os peptídeos revelou um efeito aditivo na redução da lesão hepática. Um estudo final foi focado na elucidação da expressão hepática e função da Panx1 na hepatotoxicidade induzida pelo APAP, utilizando o peptídeo inibidor da Panx1, 10Panx1. Verificou-se que a inibição dos canais de Panx1 minimiza as características clínicas da hepatotoxicidade desencadeada pelo APAP, em particular a relacionada com morte celular e inflamação. Em geral, este projeto de doutorado demonstra, pela primeira vez, o envolvimento dos hemicanais de conexina e canais de pannexina na insuficiência hepática aguda induzida pelo APAP, o que sugere um papel como alvos terapêuticos para fármacos.

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Tissue homeostasis is controlled by a plethora of communication mechanisms. At the intercellular level, gap junctions allow the trafficking of small and hydrophilic messengers of less than 1.5 kilodalton between two adjacent cells. Gap junctions are built up by two hemichannels, which in turn are composed of six connexin (Cx) proteins. In liver, hepatocytes mainly produce Cx32, while non-parenchymal hepatic cells predominantly harbor Cx43. Hepatic gap junctions are known to underlie several liver-specific functions, such as albumin secretion and xenobiotic metabolism. In the last decade, it has become clear that the connexin hemichannels are not only precursors of gap junctions, but that they can also provide a communication pathway, albeit between the cytosol of individual cells and their extracellular environment. In addition, a novel class of connexin-like proteins has been identified, the pannexins (Panx), of which Panx1 is expressed in the liver. Pannexins gather in a configuration reminiscent of connexin hemichannels and also support extracellular signaling. Both connexin hemichannels and pannexin channels are believed to become preferably activated in pathological conditions and thereby to promote cell death and inflammation. The present doctoral project was set up to verify the hypothesis that this also holds true for liver disease, in particular acute liver failure. In a first instance, the hepatic connexin expression pattern was fully characterized in a mouse model of acute liver failure induced by acetaminophen (APAP). This revealed a switch from Cx32-to-Cx43 upon APAP-induced hepatotoxicity with de novo expression of Cx43 in hepatocytes. Subsequently, the functional relevance of enhanced Cx43 expression in acute liver failure was tested using Cx43-deficient mice. It was found that Cx43 has a protective effect, since liver APAP-induced injury became aggravated upon genetic ablation of Cx43. In parallel, a similar study was set up using Cx32 knock-out mice, showing no major differences in the extent of APAP-induced hepatotoxicity compared to wild type animals. Since connexin-deficient animals do not allow to discriminate between gap junction communication and connexin hemichannel signaling, a next set of experiments relied on the use of claimed peptide-based inhibitors of Cx32 and Cx43 hemichannels, namely TAT-Gap24 and TAT-Gap19, respectively. Following testing of their specificity and efficiency in vitro, both peptides were administered to APAPoverdosed mice. While TAT-Gap24 clearly reduced liver cell death and inflammation, TAT-Gap19 only had marginal effects on liver injury. Furthermore, co-treatment of APAPintoxicated mice with both peptides revealed an additive effect in lowering liver injury. A final study was focused on elucidating the hepatic expression and role of Panx1 in APAPinduced hepatotoxicity using the Panx1 inhibiting peptide 10Panx1. It was found that inhibition of Panx1 channels counteracts the clinical features of APAP-triggered hepatotoxicity, in particular related to cell death and inflammation. Overall, this doctoral 10 project shows for the first time the involvement of connexin hemichannels and pannexin channels in APAP-induced acute liver failure, which suggests a role as therapeutic drug targets.

Biblioteca responsável: BR68.1