Avaliação do uso de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a autenticação do Salmo salar utilizado em pratos da culinária japonesa e para a pesquisa de Salmonella sp. em amostras de salmão submetidos a infecção experimental

RESUMO

Dentre os pescados mais apreciados no mundo as espécies de salmão merecem destaque, estando entre os peixes mais consumidos como alimento cru, principalmente em pratos do tipo sushi e sashimi. Porém, apesar dos benefícios atribuídos ao salmão, o aumento do consumo deste alimento levou ao surgimento de surtos de infecção por agentes patogênicos. Dentre as bactérias patogênicas, as pertencentes ao gênero Salmonella sp. vem se destacando como as principais responsáveis por casos de infecções alimentares. Além da qualidade microbiológica, a autenticidade do pescado utilizado em pratos à base de salmão também tem sido alvo de estudo, visto que, devido à importância comercial do Salmo salar, muitas fraudes estão sendo praticadas por comerciantes. Portanto, o objetivo deste trabalho foi padronizar uma PCR para a detecção de Salmo salar, através da produção experimental de sushi e da análise de amostras comercialmente disponíveis e estabelecer o limite de detecção de uma PCR, para a identificação de Salmonella sp. em amostras de Salmo salar submetidas a etapa de pré-enriquecimento, bem como sugerir um método de extração de DNA adequado, que pode ser utilizado na pesquisa do referido agente em diferentes técnicas moleculares. Para isto, para o teste de autenticação do salmão, dois lotes de sushi foram produzidos experimentalmente e 38 estabelecimentos que comercializam comida japonesa e 10 peixarias na região metropolitana de Belém foram visitados, visando a coleta do sushi, temaki e do pescado pertencente à espécie Salmo salar. Já para a padronização de uma PCR para a detecção de Salmonella sp., uma contaminação artificial foi realizada em amostras de Salmo salar, com cepa padrão de Salmonella enteritidis. Tanto as amostras comerciais quanto as experimentais foram submetidas a um protoco de extração de DNA adequado, para que as amostras fossem posteriormente submetidas as reações de PCR propostas . Os resultados demostraram que a técnica proposta para a autenticação de Salmo salar foi eficiente, visto que a espécie foi detectada tanto nas amostras de sushi preparados experimentalmente quanto nas alíquotas de pescado isolados, utilizados para a preparação do sushi. Além do mais, foi possível confirmar a utilização da espécie Salmo salar no preparo das amostras de sushi, temaki e pescado analisadas. Já os resultados obtidos através da PCR para identificação de Salmonella sp. demonstraram a presença do agente em todas as diluições a partir da hora 18 de incubação, sendo a concentração bacteriana inicial mínima detectada de 1X100 UFC/mL. Quanto a extração de DNA, a metodologia testada revelou-se apropriada para ser utilizada como etapa essencial de execução da PCR. Conclui-se que a técnica utilizada para autenticação do pescado foi capaz de amplificar o DNA da referida espécie (Salmo salar) e o método apresentado para identificação bacteriana de Salmonella sp. mostrou ser uma alternativa confiável para detecção do agente em amostras de Salmo salar em um curto espaço de tempo.

ABSTRACT

Among the most popular fish in the world, salmon species deserve special mention, being among the fish most consumed as raw food, mainly in sushi and sashimi dishes. However, despite the benefits attributed to salmon, increased consumption of this food has led to outbreaks of infection by pathogens. Among the pathogenic bacteria, those belonging to the genus Salmonella sp. has been highlighted as the main responsible for cases of food infections. Besides the microbiological quality, the authenticity of the fish used in salmon dishes has also been studied, since, due to the commercial importance of Salmo salar, many frauds are being practiced by merchants. Therefore, the objective of this work was to standardize a PCR for the detection of Salmo salar, through the experimental production of sushi and the analysis of commercially available samples and establish the limit of detection of a PCR, for the identification of Salmonella sp. in samples of Salmo salar submitted to the pre-enrichment stage, as well as to suggest a suitable DNA extraction method, that can be used in the research of said agent in different molecular techniques. To this end, for the salmon authentication test, two lots of sushi were experimentally produced and 38 establishments selling Japanese food and 10 fishmongers in the metropolitan area of Belém were visited for the collection of sushi, temaki and fish belonging to the species Salmo Salar. For the standardization of a PCR for the detection of Salmonella sp., an artificial contamination was carried out on samples of Salmo salar, with standard strain of Salmonella enteritidis. Both commercial and experimental samples were submitted to an appropriate DNA extraction protocol, so that the samples were subsequently submitted to the proposed PCR reactions. The results demonstrated that the technique proposed for the authentication of Salmo salar was efficient, since the species was detected both in experimentally prepared sushi samples and in isolated fish aliquots used for the preparation of sushi. Furthermore, it was possible to confirm the use of the Salmo salar species in the preparation of the analyzed sushi, temaki and fish samples. The results obtained through PCR for identification of Salmonella sp. demonstrated the presence of the agent in all dilutions from the 18 hour incubation, with the minimum initial bacterial concentration detected being 1X100 CFU/mL. As for DNA extraction, the methodology tested proved appropriate to be used as the essential step of PCR execution. It is concluded that the technique used to authenticate the fish was able to amplify the DNA of this species (Salmo salar) and the method presented for bacterial identification of Salmonella sp. was shown to be a reliable alternative for detecting the agent in Salmo salar samples in a short time.