VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO DE FETOS BOVINOS ASSOCIADA AO RESVERATROL

RESUMO

Objetivou-se com este estudo analisar a morfologia e a viabilidade tecidual de folículos ovarianos pré-antrais de fetos bovinos por meio de análise histológica, sondas fluorescentes em microscopia confocal, antes e após os procedimentos de vitrificação/ aquecimento com ou sem o antioxidante resveratrol. Foram fragmentados 18 ovários e os fragmentos distribuídos aos grupos controle (C), vitrificado sem resveratrol (SR) e vitrificado com resveratrol (CR) na concentração de 20 µM. No experimento 1 foi realizada análise morfológica dos folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de tecidos ovarianos por histologia clássica. Os folículos pré-antrais foram quantificados e classificados de acordo com a fase de desenvolvimento. O percentual médio de folículos normais foi maior (P < 0,05) no grupo de folículos vitrificados com resveratrol em relação aos vitrificados sem a adição do antioxidante. No grupo de folículos vitrificados com resveratrol a classe de folículos primordiais apresentou maior percentual (P < 0,05) de folículos normais. Em contrapartida a classe de folículos secundários apresentou o menor percentual (P < 0,05) de folículos normais em todos os tratamentos. Adicionalmente, foi observada uma associação negativa entre a proporção de folículos viáveis e o estágio de desenvolvimento folicular. A probabilidade de se encontrar folículos viáveis foi superior (P < 0,05) no grupo de folículos vitrificados na presença do resveratrol e os folículos primordiais do grupo com resveratrol apresentaram 2,5 vezes mais chance de viabilidade após a vitrificação. A chance de se observar folículos normais foi maior (P < 0,05) nas fases iniciais de desenvolvimento folicular. O diâmetro dos folículos de transição e de seus respectivos ovócitos foi menor quando submetidos ao processo de vitrificação com resveratrol (P < 0,05). Na classe de folículos primários, os diâmetros foliculares e ovocitários foram semelhantes (P > 0,05) entre os grupos estudados. No experimento 2 foi realizada a análise de viabilidade tecidual por meio da técnica de microscopia confocal que avaliou os níveis de emissão de espécies reativas de oxigênio (EROs- DCF) e de viabilidade tecidual (iodeto de propídeo- IP). Os níveis de degeneração tecidual no grupo de fragmentos vitrificados com resveratrol foram semelhantes (P > 0,05) aos do grupo controle. Os níveis de EROs foram semelhantes entre os grupos vitrificados e vitrificados com resveratrol e inferior em relação ao grupo controle. A intensidade de fluorescência emitida com a utilização de ambas probes diminuiu (P < 0,05) com o aumento da profundidade tecidual analisada. Além disso, a análise de regressão linear apresentou correlação negativa entre intensidade de fluorescência e a profundidade tecidual. Observou-se uma associação positiva (P < 0,01) entre os níveis de células degeneradas e as taxas de EROs produzidas nos tratamentos em diferentes profundidades do tecido ovariano, independentemente do tratamento e da profundidade tecidual os grupos apresentaram similaridade para os baixos EROs. A proporção de fragmentos com alto nível de EROs foi superior no grupo controle comparado aos grupos vitrificados. Em conclusão, o resveratrol favoreceu a preservação de folículos ovarianos pré-antrais em fases iniciais de desenvolvimento quando submetidas ao processo de vitrificação/ aquecimento, além de proporcionar redução na produção de EROs e maior viabilidade celular.

ABSTRACT

The aim of this study was to analyze the morphology and tissue viability of preantral follicles of bovine fetuses by means of histological analysis, fluorescence probes diacetate diclodihydrofluocein and propidium iodide in confocal microscopy, before and after vitrification / warning procedures without or with antioxidant resveratrol. The ovaries (n=18) were fragmented and the fragments distributed to the control (C) groups, vitrified without resveratrol (SR) and vitrified with resveratrol (CR) at the concentration of 20 M. The experiment 1, morphological analysis of the preantral follicles included in fragments of ovarian tissues by classical histology was performed. The preantral follicles were quantified and classified according to the developmental stage. The mean percentage of normal follicles was higher (P <0.05) in the group of follicles vitrified with resveratrol than in the vitrified without the addition of the antioxidant. In the group of follicles vitrified with resveratrol the class of primordial follicles had a higher percentage (P <0.05) of normal follicles. In contrast, the secondary follicle class had the lowest percentage (P <0.05) of normal follicles in all treatments. In addition, a negative association was observed between the proportion of viable follicles and the stage of follicular development. The probability of finding viable follicles was higher (P <0.05) in the group of vitrified follicles in the presence of resveratrol and follicles of the group with resveratrol presented 2.5 times more chance of viability after vitrification. The chance of observing normal follicles was higher (P <0.05) in the early stages of follicular development. The diameter of the transitional follicles and their respective oocytes was lower when submitted to the vitrification process with resveratrol (P <0.05). In the primary follicle class, the follicular and oocyte diameters were similar (P> 0.05) between the studied groups. The experiment 2, the tissue viability analysis was performed using a confocal microscopy technique that evaluated the fluorescence levels emitted by DCF and IP. The fluorescence levels emitted by PI in the group of fragments vitrified with resveratrol were similar (P> 0.05) to the control group. The levels of EROs were similar between the vitrified and vitrified groups with resveratrol and lower in relation to the control group. The intensity of fluorescence emitted with the use of both probes decreased (P <0.05) with the increased tissue depth analyzed. In addition, linear regression analysis showed a negative correlation between fluorescence intensity and tissue depth. A positive association (P <0.01) was observed between the degenerate cell levels and the ROS rates produced in the treatments with different depths of ovarian tissue, regardless of treatment and tissue depth, groups showed similarity to low ROS.. The proportion of fragments with high level of EROs was higher in the control group compared to the vitrified groups. In conclusion, resveratrol favored the preservation of preantral follicles in the early stages of development when submitted to the vitrification / warning process, as well as to reduce the production of ROS and greater cell viability