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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-208631

Resumo

Os papilomavírus bovino (BPV) tipos 2 e 13 estão envolvidos na etiologia do sarcoide equinos e também da hematúria enzoótica bovina. O objetivo do presente estudo foi desenvolver a técnica PCR em tempo real (qPCR), utilizando SYBR Green, para quantificar o oncogene E6 do BPV2 e 13 em quatro amostras de sarcoides de um equino e 12 amostras de lesões proliferativas de bexiga de bovinos. Avaliações histopatológicas das amostras confirmaram a presença de tumores fibroblásticos tipo sarcoide e dos carcinomas de bexiga. Com o objetivo de otimizar a qPCR, dois pares de primers foram desenvolvidos para amplificar um fragmento de 120 pb do oncogene E6, sendo um par específico para o BVP2 e outro para o BPV13, os controles positivos foram obtidos do acervo de papilomas do laboratório de virologia animal da Universidade Estadual de Londrina. O produto da amplificação deste fragmento foi clonado utilizando kit comercial e quantificado para o desenvolvimento da curva padrão. A reprodutibilidade foi analisada por meio de diluições seriadas (6x) dos produtos da clonagem do BPV2 e do BPV13. O sequenciamento dos amplicons foi realizado para confirmar a especificidade das reações. Nenhuma reação inespecífica com relação a outros tipos de BPVs foi identificada. O limite de detecção (LOD) da PCR convencional e qPCR foi avaliado testando o produto da amplificação de seis diluições seriadas dos controles positivos padrões. Os LOD para a PCR convencional para o BPV2 e 13 foram de aproximadamente 114 e 154 cópias de DNA, respectivamente, enquanto para qPCR, foram de 11,4 e 15,4 cópias de DNA viral de BPV2 e 13, respectivamente. Quatro amostras de sarcoide de um equino macho e doze fragmentos de carcinoma de bexigas bovinas foram coletadas e testadas pela nova qPCR. Amostras de swab de pele equina e mucosa de bexiga bovina sem lesão também foram testadas. O fragmento do oncogene E6 foi amplificado em 8/12 amostras de tumores de bexiga, sendo seis positivas para o BPV2, duas para o BPV13 e uma para ambos os tipos. O valor de Cq variou de 23,84 a 26,32 (1,05 x 104 até 9,53 x 103 cópias/µL) para o BPV2, e 23,41 e 24,96 (1,30 x 104 e 1,23 x 104 cópias/µL) para o BPV13. Nas amostras de sarcoide, em duas foi amplificado o oncogene E6 do BPV2, com Cq 21,16 e 21,43 (1.18 x 104 e 1.17 x 104 cópias/µL), e nas outras duas o E6 de BPV13 com Cq 18,9 e 19,1 (1.62 x 104 e 1.60 x 104 cópias/µL). O presente estudo confirmou o envolvimento do BPV2 e 13 na etiologia do sarcoide equino e na formação de lesões proliferativas em bexiga de bovinos e reforça a importância da participação do oncogene E6 de BPV2 e 13 na etiopatogenia destes tipos tumores podendo abrir novas perspectivas para o tratamento e profilaxia dessas importantes neoplasias em saúde animal.

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The bovine papillomavirus (BPV) types 2 and 13 are involved in the etiology of equine sarcoids as well as bovine enzootic hematuria. The aim of this study was to standardize a realtime PCR (qPCR), using SYBR Green, to quantify the E6 oncogene of BPV2 and 13 in four equine sarcoid samples and 12 samples of urinary bladder tumors in cattle. Histopathological evaluations confirmed the presence of fibroblastic proliferation in sarcoid tumors and bladder tumors. In order to standardize qPCR, two primer pairs were designed to amplify a 120 bp fragment of the E6 oncogene, a specific pair for BPV2 and another for BPV13, positives controls were obtained from the collection of laboratory of virology animal of State University of Londrina. The amplification product of this fragment was cloned using commercial kit, and quantified for development of the standard curve. Reproducibility was analyzed using six-fold serial dilutions of the cloning products of BPV2 and 13. Sequencing was performed to confirm the specificities of the reactions. No cross-reaction was detected with other BPVs. The limit of detection (LOD) of the standard PCR and qPCR was evaluated by testing the amplification product of six serial dilutions of the standard positive controls. The LODs for conventional PCR for BPV2 and 13 were approximately 114 and 154 copies of DNA, respectively, whereas for qPCR, LODs were 11.4 and 15.4 copies of BPV2 and 13 viral DNA, respectively. Four sarcoid samples from one male equine and twelve bovine bladder carcinoma fragments were collected and tested by the new qPCR. Equine skin swab samples and lesionless bovine bladder mucosa were also tested. The E6 oncogene fragment was amplified in 9/12 samples of urinary bladder tumors, six of which were positive for BPV2, two were positive for BPV13 and one for both BPVs types, the Cq ranged from 23.84 to 26.32 (1.05 x 104 to 9.53 x 103 copies/µL) for BPV2 and 23.41 to 24.96 (1.30 x 104 to 1.23 x 104 copies/µL) for BPV13. In the sarcoid samples, the oncogene E6 of BPV2 were amplified in two samples, the Cq were 21.16 and 21.43 (1.18 x 104 to 1.17 x 104 copies/µL), and the other two samples were obtained BPV13 amplified with Cq 18.9 and 19.1 (1.62 x 104 and 1.60 x 104 copies/µL). The present study confirmed the involvement of BPV2 and 13 in the etiology of equine sarcoid and in the formation of urinary bladder lesions in cattle and reinforces the importance of the participation of BPV2 and BPV13 E6 oncogene in the etiopathogenesis of these two types of tumors and may open new perspectives for the treatment and prophylaxis of these important neoplasia in animal health.

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