CITOMETRIA DE FLUXO COMO FERRAMENTA NA DETERMINAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA

RESUMO

A resistência antimicrobiana é uma preocupação constante. Para evitar o surgimento de novas cepas bacterianas multirresistentes é necessário investir em pesquisas e tecnologias de avaliação da atividade antimicrobiana. Diversos métodos laboratoriais estão disponíveis para avaliação da susceptibilidade antimicrobiana in vitro, permitindo a escolha terapêutica correta em aproximadamente 20 h após cultura positiva. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas metodologias para avaliar o perfil de susceptibilidade antimicrobiana, de forma rápida e precisa, irá contribuir para a utilização racional dos fármacos e, consequente, redução e/ou controle da resistência bacteriana, e aumento na sobrevida dos pacientes. O objetivo do nosso trabalho foi desenvolver um protocolo rápido de determinação de susceptibilidade aos antimicrobianos por meio da técnica de citometria de fluxo. Para padronização desse procedimento utilizamos 6 antimicrobianos, uma cepa bacteriana de Escherichia coli (ATCC 25922) sensível a todos os antimicrobianos, além de isolados clínicos de E. coli resistentes aos mesmos antimicrobianos. Os isolados foram submetidos previamente ao método de disco-difusão para avaliação do perfil de susceptibilidade. As cepas selecionadas foram cultivadas em caldo LB, lavadas e quantificadas por citometria de fluxo. Concentrações padrões dos antimicrobianos foram adicionadas à 104 E.coli e incubadas por 1, 2 ou 3 h à 37°C. Em seguida, as amostras foram marcadas com iodeto de propídeo (PI) e analisadas por citometria de fluxo. A determinação da viabilidade bacteriana baseou-se no conceito de que o marcador de ácido nucléico PI é capaz de penetrar membranas celulares danificadas, marcando o DNA celular e assim, diferenciando as populações viáveis e inviáveis. Para validação da técnica, cada amostra, em seus respectivos tempos de tratamento foram submetidas também a contagem bacteriana por meio de plaqueamento em meio LB, e a taxa de sobrevivência/crescimento foi determinada após incubação à 36°C por 18-24 h. A utilização da técnica de citometria de fluxo permitiu avaliar a susceptibilidade antimicrobiana em poucas horas. Porém ao compararmos a técnica com a contagem em placas, não foi possível estabelecer uma correlação positiva, pois a citometria apresentou um percentual de viabilidade superior ao método tradicional. Isso pode ser explicado pela presença de subpopulações viáveis, porém não cultiváveis, incapazes de formar colônias em ágar. Por outro lado, se considerarmos os isolados resistentes, a citometria de fluxo possibilitou determinar a resistência antimicrobiana com precisão, fator determinante para o sucesso no tratamento de infecções por microrganismos multirresistentes. A citometria de fluxo pode ser aprimorada como uma alternativa na detecção de cepas multirresistentes.

ABSTRACT

Antimicrobial resistance is a relevant matter to public health. Investments on research and new technologies to evaluate antimicrobial activity are much needed to avoid the surge of new multiresistant strains. Several techniques are available to evaluate antimicrobial activity in vitro in less than 24 h after a positive isolation, allowing to properly choosing the right antibiotic to be used. In this scenario, the development of new methods to quickly and precisely evaluate the antimicrobial susceptibility profile of bacterial isolates would be invaluable for the rational use of antibiotics and, as a consequence, to reduce or even control the surge of bacterial resistance and to prolong patients life expectation. Thus, in this study our main goal was to develop a quick protocol to evaluate antimicrobial susceptibility using flow cytometry. We used six antimicrobial drugs, a strain of Escherichia coli (ATCC 25922) susceptible to all antimicrobials, and clinical isolates of E. coli resistant to the same antimicrobial drugs. Prior to testing, the susceptibility profile of all isolates was tested by the disc-diffusion method. The isolates were then cultivated in liquid LB, washed and quantitated by flow cytometry. Standard concentration of antimicrobial drugs were added to 104 E. coli cells and incubated for 1, 2 or 3 h at 37ºC. After that, the samples were mixed with propidium iodine (PI) and analyzed by flow cytometry. Viable bacteria were differentiated from unviable in that PI penetrates damaged membranes staining the DNA of death bacteria. As controls to validate this procedure, each bacterial isolate at each indicated time was also collected and seeded on LB agar plate to enumerate the number of viable cells by the classical method and the growing/survival rate was also evaluated in the same samples after incubating for 20h at 36ºC. By using flow cytometry we were able estimate antimicrobial susceptibility in few hours. However, it was not possible to set a positive correlation with plaque counting in that we found a higher percentile of viable cells by flow cytometry. This phenomenon might be explained by the presence of viable but non-cultivable bacterial subpopulations unable to form colonies in agar plates. In the other hand, by using flow cytometry and considering the resistant isolates, we were able to define precisely the resistant characteristics of a given isolate, and this is invaluable for treating infection by multidrug resistant isolates. Thus, we conclude that flow cytometry should be optimized and used as an alternative tool to detect multiresistant bacterial isolates.