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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-208823

Resumo

A mastite é a principal doença que acomete os rebanhos leiteiros e promove grandes perdas na produção devido a alterações na composição do leite e prejuízos na saúde do animal, aumentando assim os custos de produção. Caracteriza-se pela resposta inflamatória da glândula mamária a agentes infecciosos, alterando sua fisiologia e metabolismo. Estudo de expressão gênica vem sendo empregado em vários organismos com a finalidade de identificar genes relacionados com características economicamente importantes como resistência a doenças. Com o objetivo de compreender melhor os mecanismos de resposta imune envolvidos no fenótipo de resistência/susceptibilidade à mastite, foi realizada a quantificação da expressão relativa dos genes do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos 3 (CSF3) e Lactoperoxidase (LPO), em leite de búfalas mestiças saudáveis e com mastite, por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Para isso, foi realizada a extração de RNA total, com Trizol, de células somáticas do leite de doze animais diagnosticados com mastite e de doze animais livres da infecção. Foram realizadas análises de qualidade e quantificação do RNA total e das contaminações por DNA genômico para garantir a integridade das amostras. A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio do método do Delta Delta Ct. Os genes GAPH, HPRT1, EEF1A1 e RPLP0, foram selecionados na literatura, e testados como genes de referência. As análises referentes às quantificações foram realizadas com os valores de Ct obtidos para cada gene. O gene CSF3 foi significativamente mais expresso em animais com mastite em comparação com animais sem mastite (P<0,001) e 5,14 vezes mais expresso na amostra alvo do que na amostra de referência. O CSF3 é uma citocina naturalmente produzidas e secretadas por uma grande variedade de células pertencentes ou não ao sistema imune. Desempenham importante papel na defesa do hospedeiro, já que regulam parte da atividade das células que participam da imunidade inata e específica, o que demonstra importância no seu uso no diagnóstico e prognóstico das mastites. O gene LPO expressa uma proteína sintetizada na glândula mamária por íons tiocianato (SCN-), originados por metabolismo hepático e peróxido de hidrogênio (H2O2), derivado da atividade dos leucócitos e outras células, para gerar produtos reativos com intensa atividade antimicrobiana. Esse foi 2,41 vezes mais expresso em animais com mastite em relação a animais sem mastite (p-valor = 0,097), não havendo diferença significativa, porém a mastite é uma doença multifatorial e afetada por muitos genes, sendo necessário mais estudos com animais em diferentes fases de infecção e incluindo outros genes para compreender o mecanismo de resposta imune relacionado a mastite.

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Mastitis is the main disease affecting dairy herds and causes large production losses due to changes in milk composition and damage to animal health, thus increasing production costs. It is characterized by the inflammatory response of the mammary gland to infectious agents, altering its physiology and metabolism. Gene expression studies have been used in several organisms to identify genes related to economically important characteristics such as disease resistance. In order to better understand the mechanisms of immune response involved in the mastitis resistance / susceptibility phenotype, the relative expression of the Granulocyte Colony Stimulating Factor 3 (CSF3) and Lactoperoxidase (LPO) genes in milk of Healthy mestizo buffaloes with mastitis by means of the quantitative real-time PCR technique (qRT-PCR). For this, total RNA extraction was performed with Trizol from milk somatic cells from twelve animals diagnosed with mastitis and from twelve animals free of infection. Quality assays and quantification of total RNA and contamination by genomic DNA were performed to guarantee the integrity of the samples. Quantification of the gene expression was performed by the Delta Delta Ct method. The genes GAPH, HPRT1, EEF1A1 and RPLP0, were selected in the literature, and tested as reference genes. Quantification analyzes were performed with the Ct values obtained for each gene. The CSF3 gene was significantly more expressed in animals with mastitis compared to animals without mastitis (P <0.001) and 5.14 times more expressed in the target sample than in the reference sample. CSF3 is a cytokine naturally produced and secreted by a wide variety of cells belonging or not to the immune system. They play an important role in the defense of the host, since they regulate part of the activity of the cells that participate in the innate and specific immunity, which demonstrates importance in its use in the diagnosis and prognosis of mastitis. The LPO gene expresses a protein synthesized in the mammary gland by thiocyanate ions (SCN-), caused by hepatic metabolism and hydrogen peroxide (H2O2), derived from the activity of leukocytes and other cells, to generate reactive products with intense antimicrobial activity. This was 2.41 times more expressed in animals with mastitis than in animals without mastitis (p-value = 0.097), but there was no significant difference, but mastitis is a multifactorial disease affected by many genes and further animal studies At different stages of infection and including other genes to understand the mechanism of immune response related to mastitis.

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