Portal de Pesquisa da BVS Veterinária

Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-208954

Resumo

A biotecnologia de phage display pode ser utilizada em uma grande variedade de aplicações, como a seleção de fagos que mimetizam a aflatoxina, um metabólito fúngico que compromete a saúde pública e a produção animal, causando doença hepática severa, neoplasias e perdas econômicas. Na técnica de phage display, bibliotecas de fagos podem ser rastreadas para seleção de peptídeos ligantes de anticorpos: a vacinação com estes fagos induz a produção de anticorpos anti-peptídeo que também podem reconhecer o antígeno original. Desta forma, os objetivos do presente trabalho foram selecionar clones altamente reativos miméticos de aflatoxina B1, buscando o desenvolvimento de imunógenos capazes de induzir a produção de anticorpos anti-aflatoxina. As adequações da técnica de phage display previamente estabelecida permitiram a prospecção dos clones miméticos de aflatoxina 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23 e 3P30 que foram ligantes de anticorpo monoclonal anti-AFB1. Os resultados dos imunoensaios executados indicaram a alta especificidade de peptídeos expressos por estes fagos em mimetizar in vitro as características imunológicas correspondentes à AFB1 em anticorpo específico anti-AFB1. Desta forma, foi observado que a reatividade do fago com o anticorpo foi dependente das concentrações de fago estabelecidas, assim como não houve reatividade frente a moléculas irrelevantes. Fagos expressando mimotopos de baixa reatividade (como o fago 3P25 e o fago silvestre) não foram capazes de estabelecer esta condição, indicando que os mimotopos selecionados corresponderam complementarmente ao sítio de ligação ao antígeno em anticorpo anti-AFB1. A partir da sequência aminoacídica obtida dos mimotopos selecionados, QTDLDYLHPLINSWN, o peptídeo mimético de aflatoxina foi sintetizado e conjugado à molécula carreadora para validação do potencial imunogênico. O resultado das estratégias de imunização com mimotopos e peptídeo sintético indicou que os imunógenos foram eficientes na indução de anticorpo anti-peptídeo que também foi capaz de reconhecer o antígeno original. Portanto, o mimetismo molecular do peptídeo selecionado por phage display foi confirmado, permitindo o emprego do fago como imunógeno para o desenvolvimento de uma vacina de subunidades, através do encapsulamento em nanopartículas de quitosana. Este biopolímero permitiu a administração intranasal do imunógeno e o reconhecimento do antígeno pelo sistema imune de mucosa, configurando uma plataforma eficiente na indução de anticorpos específicos anti-aflatoxina. A proposta desse modelo vacinal para o controle de micotoxinas constitui uma nova linha de pesquisa na medicina veterinária e uma alternativa para o desenvolvimento da produção animal. Posteriormente, esta abordagem racional poderá ser aplicada a outras micotoxinas que afetam as populações humana e animal.

---

Phage display biotechnology is a widely applied technology, and has been proven as useful tool in selecting peptides epitopes that mimic antigens such as aflatoxin, a fungal metabolite that compromises animal production and human health, leading to severe liver intoxication, cancer and economic losses. By phage display technique, phage libraries could be screened for selection of mimotopes, small peptides that structurally mimic a given antibody-binding site of an epitope. Active immunization based on these mimotopes induced antibodies that recognized the mimicked epitope. In the study reported herein highly reactive clones that mimicry the immunological specificity of aflatoxin B1 were selected, seeking the development of immunogens capable to induce the production of anti-aflatoxin antibodies. Through adaptations of the previously established phage display technique the 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23 and 3P30 clones were selected for being antigen-binding site specific ligands in anti-AFB1 monoclonal antibody. The immunoassays performed indicated high specificity of phage-displayed peptides in mimicking in vitro the immunological characteristics corresponding to AFB1 in specific antibody. The specificity was defined by the ability of a clone to be identified only by its cognate target anti-AFB1 monoclonal and polyclonal antibodies among different irrelevant ligands. Any clone showed specificity for BSA or irrelevant murine IgG. However, some clones 3P4, 3P5 and 3P16 exhibited recognition against the irrelevant monoclonal and rabbit polyclonal antibodies, which indicates that these clones were less specific than other selected clones. The affinity-selected phages exhibited a concentration-dependence profile: the reduction on phage concentration from 1011 to 108 pfu mL-1 causes a decreased reactivity towards the anti-AFB1 monoclonal antibody, while any interference was observed with the irrelevant phage 3P25 or WTP. These results also indicate that the phage-displayed peptides represented the binding site of the aforementioned antibody. Therefore, the peptide sequence of the selected mimotopes, QTDLDYLHPLINSWN, was synthesized and conjugated to protein carriers to validate the immunogenic potential. Immunization of mice with phage-displayed mimotopes and synthetic peptide suggested that the immunogens were efficiently specific in the induction of anti-AFB1 antibodies. Thus, the molecular mimicry of selected peptide was confirmed as an immunogen for development of epitope-based vaccine by encapsulation of bacteriophage into chitosan nanoparticles. This biopolymer allowed the intranasal administration of the immunogen and recognition of the antigen by the mucosal immune system, providing an efficient platform for the induction of specific anti-aflatoxin antibodies. The proposal of a vaccine model for the control of mycotoxins establishes a new research line in veterinary medicine and an alternative for the development of animal production. Hereafter, this rational approach may be applied to other mycotoxins that affect human and animal populations.

Biblioteca responsável: BR68.1