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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-212792

Resumo

A manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais permite aumentar o potencial reprodutivo e garantir a conservação da biodiversidade. Neste sentido, objetivou-se estabelecer protocolos eficientes para o isolamento, cultivo e criopreservação de folículos pré-antrais de catetos. Em um primeiro experimento, ovários de seis fêmeas adultas foram destinados a diferentes métodos de isolamento folicular: enzimático utilizando a colagenase tipo IV, mecânico, utilizando lâmina de bisturi, e associação de ambos. Dentre estes, a maior quantidade (P < 0,05) de folículos foi obtido pelo método enzimático (961,7 ± 132,9), o qual também resultou na maior percentagem de folículos viáveis (98,7 ± 0,6%). Em adição, a integridade dos folículos obtidos pelo método enzimático foi confirmada pela microscopia eletrônica de varredura e por fluorescência (86%) após cultivo de 24 h. No segundo experimento, identificou-se a expressão dos receptores ALK-5 (tipo I) e BMPRII (tipo II) em fragmentos ovarianos de catetos por meio de PCR. Em seguida, procedeu-se o cultivo in vitro de tecido ovariano de seis animais por 1 ou 7 dias com Fator de Crescimento e Diferenciação 9 GDF-9 (0, 50, 100 ou 200 ng/mL). Verificou-se que os folículos cultivados por 7 dias com 200 ng/mL de GDF-9 mantiveram o diâmetro folicular e oocitário similar àqueles observados no dia 1. Em comparação com o controle fresco, a porcentagem de folículos em crescimento foi significativamente em todos os tratamentos, especialmente na concentração 200 ng/mL de GDF-9 por 7 dias. Ainda, a presença de GDF-9 a 200 ng/mL melhorou a proliferação celular após o cultivo. No experimento 3, o tecido ovariano foi vitrificado tanto em uperfície sólida como no sistema cryosystem com 3M etilenoglicol (EG), 3M dimetilsulfóxido (DMSO) ou 1,5 M EG associado a 1,5 M DMSO. Após vitrificação, constatou-se que todos os tratamentos mantiveram, de modo similar, a proporção de folículos viáveis e a ocorrência de proliferação celular. No entanto, todos os tratamentos mantiveram a proporção de PFs normais como o grupo controle (75,6 ± 8,6%), exceto (P <0,05) os vitrificados por SSV com EG (52,8 ± 5,9%) ou a combinação de CPAs (54,5 ± 10,4%). Finalmente, a partir da análise da expressão de caspase 3-ativada, apenas as amostras processadas por SSV com EG (43,4%) ou CPAs (33,4%), bem como aquelas vitrificadas em OTC com EG (46,7%), forneceram valores semelhantes aos encontrados para grupo controle fresco (36,7%). Diante destes resultados, sugere-se que o método enzimático é um procedimento eficiente para o isolamento de folículos pré-antrais de catetos; existe receptores BMPR2 e ALK-5 para o GDF-9 no cortex ovariano de cateto e que o GDF-9 na concentração de 200 ng / mL é importante para o desenvolvimento in vitro de folículos ovarianos dessa espécie. Ainda, a vitrificação usando o método OTC com etilenoglicol (3M) como crioprotetores é eficiente para preservação do tecido ovariano de catetos.

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The manipulation of oocytes included in pre-antral ovarian follicles increases the reproductive potential and ensures the conservation of biodiversity. In this sense, the objective was to establish efficient protocols for the isolation, culture and cryopreservation of preantral follicles of peccary (Pecari tajacu). In a first experiment, ovaries of six adult females were assigned to different methods of follicular isolation: enzymatic using collagenase type IV, mechanical using a scalpel blade, and association of both. Among these, the highest amount (P <0.05) of follicles was provided by the enzymatic method (961.7 ± 132.9), which also provided the highest proportion of viable follicles (98.7 ± 0.6%). In addition, the integrity of the follicles obtained by the enzymatic method was confirmed by scanning electron microscopy and by fluorescence (86%) after 24h culture. In the second experiment, the expression of ALK-5 (type I) and BMPRII (type II) receptors was identified in ovarian fragments of hips by means of PCR. Then, in vitro culture of ovarian tissue of six animals for 1 or 7 days with GDF-9 (0, 50, 100 or 200 ng / ml) was performed. The follicles cultured for 7 days with 200 ng / mL of GDF-9 maintained the follicular and oocyte diameter similar to those observed on day 1. Compared to fresh control, the percentage of growing follicles was significantly increased in all the treatments, especially in 200 ng / ml GDF-9 for 7 days. In addition, the presence of 200 ng / ml GDF-9 improved cell proliferation after cultivation. In experiment 3, ovarian tissue was vitrified on solid surface and cryosystem systems with 3 M ethylene glycol (EG), 3 M dimethylsulfoxide (DMSO) or with 1.5 M EG plus 1.5 M DMSO. After vitrification, all treatments were found to have similarly maintained the proportion of viable follicles and the occurrence of cell proliferation. However, all treatments maintained the proportion of normal PFs as the control group (75.6 ± 8.6%), except (P <0.05) those vitrificated by SSV with EG (52.8 ± 5.9%) or the combination of CPAs (54.5 ± 10.4%). Finally, from the analysis of 3-activated caspase expression, only the samples processed by SSV with EG (43.4%) or CPAs (33.4%), as well as those glazed with OTC with EG (46.7%), provided values similar to those found for the fresh control group (36.7%). Considering these results, it is suggested that the enzymatic method is an efficient procedure for the isolation of preantral follicles of peccaries; there are BMPR2 and ALK-5 receptors for GDF-9 in the ovarian cortex and GDF-9 at a concentration of 200 ng / mL is important for the in vitro development of ovarian follicles of this species. Further, vitrification using the OTC method with ethylene glycol (3M) as cryoprotectants is efficient for preservation of ovarian tissue from peccaries.

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