PADRONIZAÇÃO DE UMA PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO SIMULTÂNEA DA PRESENÇA DE SALMONELLA SPP. E DA AUTENTICIDADE DE SALMO SALAR EM PRATOS DA CULINÁRIA JAPONESA

RESUMO

O consumo mundial do pescado tem sofrido um crescimento significativo nos últimos anos em decorrência do aumento populacional e da busca por alimentos mais saudáveis. Entre as formas mais consumidas desses produtos, destacam-se as inspiradas na culinária japonesa, como os sushis e sashimis. Nesses pratos, o pescado de maior valor comercial e nutricional é o salmão, um salmonídeo pertencente à espécie Salmo salar, que pelo alto valor agregado tem sido alvo de fraudes por substituição. Outro agravante com relação a esse tipo de alimento é a sua susceptibilidade à contaminação microbiológica, como contaminações por Vibrio parahaemolyticus e por Salmonella spp., por serem alimentos altamente manipulados e consumidos crus. Por essa razão, o objetivo desse estudo é padronizar uma PCR multiplex para a detecção simultânea de S. salar e V. parahaemolyticus e de Salmo salar e Salmonella spp. e aplicar os referidos protocolos em amostras de sushi. Para isso, inicialmente serão extraídos DNAs das espécies S. salar, V. parahaemolyticus e Salmonella Enteritidis, que serão utilizados para a padronização e como controles na PCR, na qual serão testadas diferentes temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão. Os amplicons obtidos serão submetidos a eletroforese em gel de agarose e revelados em equipamento de foto documentação. Posteriormente, lotes de sushi serão produzidos e contaminados experimentalmente para determinar o limite de detecção da técnica, onde serão avaliadas a sensibilidade e eficiência da PCR proposta. Por fim, amostras de sushi do tipo niguiri serão coletadas em restaurantes que comercializam comida japonesa na região metropolitana de Belém - PA e essas amostras serão processadas, a fim de se avaliar a aplicação da técnica em amostras comerciais. Ao final da execução dessa pesquisa, espera-se padronizar uma técnica para detecção rápida, confiável e sensível voltada à autenticação do salmão e detecção simultânea de possíveis contaminantes, desenvolvendo assim subsídios técnicos que contribuirão para a melhoria da saúde coletiva.

ABSTRACT

The world consumption of fish has undergone significant growth in recent years, due to population increase and the search for healthier food. Among the most consumed these products, are inspired by Japanese cuisine, such as sushi and sashimi. In these dishes, the fish of greater commercial and nutritional value is a salmonídeo belonging to salmon species Salmo salar, which at high added value has been the target of fraud by substitution. Another aggravating factor in relation to this type of food is its susceptibility to microbiological contamination, such as Salmonella spp. contamination, due to being highly manipulated foods and eaten raw. For this reason, the objective of this study was to standardize a multiplex PCR for simultaneous detection of S. salar and Salmonella spp. and apply this Protocol on sushi samples from experimental contamination by checking your efficiency and sensitivity. For Standardization, were purchased fish of the species s. salar, authenticated from the molecular PCR technique, which were used as positive control, and standard strain of Salmonella spp. To the standardization of the methodology proposed, tested various times and temperatures of denaturation, annealing and extension, until they take parameters common to both species, enabling simultaneous detection. Then, lots of sushi of type Makizushi were produced and contaminated with standard strain of s. Typhimurium from inoculation of 1, 2 and 3. Samples of experimental infection were collected on hours 0, 6, 12 and 18. Concomitantly, some dilutions were performed to detect the limit of concentration of the bacterium in produced sushi. The results show that it was possible to detect Salmonella spp. from 6h inoculation and that Salmo salar DNA was amplified at all hours. Therefore, it was concluded that the protocol presented here is efficient and can be a very reliable and fast tool in detecting fraud and contamination by Salmonella spp. in Japanese cuisine foods that use Salmon in its composition.