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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-212839

Resumo

Autor: Rafaela Luiza Klein Orientador: Rafael Frandoloso A pneumonia enzoótica suína (PES) é uma doença infectocontagiosa que há longa data é destaque na cadeia suinícola. A PES é causada pelo Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), uma bactéria específica de suínos que pode ser transmitida através de contato direto e indireto. A doença acomete suínos de todas as idades, porém a clínica é comumente observada na fase de crescimento e terminação de suínos. Mhyo pode produzir doença pulmonar de forma independente, no entanto, sua infecção facilita a ocorrência de inúmeras outras infecções secundárias causadoras de pneumonias e de doenças sistêmicas. O diagnóstico da circulação de Mhyo é realizada através de testes sorológicos em combinação com técnicas moleculares, e a prevenção, mediante o uso de vacinas clássicas aplicadas pela via intramuscular ou intradérmica. Em razão do diagnóstico sorológico ser de vital importância para o posicionamento correto de vacinas a partir do entendimento da cinética de anticorpos naturais adquiridos através do colostro, ou mesmo, desenvolvidos após um processo de infecção, desenvolver insumos imunológicos genuínos e capazes de detectar indiretamente ou diretamente o Mhyo são indispensáveis para o Brasil. Nesta dissertação, apresentamos o desenvolvimento e a caracterização de um anticorpo monoclonal (AcMo) contra Mycoplasma hyopneumoniae. Posteriormente, o AcMo foi utilizado para desenvolver um ELISA moderno, baseado em células inteiras de M. hyopneumoniae corretamente orientadas no interior da placa de ELISA pelo AcMo. Brevemente, células de mieloma murino P3x63Ag8.653 foram fusionadas com esplenócitos obtidos de camundongos BALB/c imunizados com uma suspensão de M. hyopneumoniae cepa ATCC25095. O AcMo obtido, nomeado de MAb 4A2, foi caracterizado por meio de Western Blot, Dot Assay, Citometria de Fluxo e Teste de Avidez. O MAb 4A2 é uma imunoglobulina da subclasse IgG1 com duas cadeias leves do tipo lambda que reconhece um epitopo linear comum presente na estrutura de duas proteínas superficiais de M. hyopnuemoniae, as quais possuem pesos moleculares de 46 e 100 kDa. O índice de avidez do MAb 4A2 foi de 0.5 M de tiocionato de amônia e reações cruzadas com Glaesserella parasuis não foram evidenciadas pelo ensaio de Dot Assay. A análise de citometria de fluxo mostrou a capacidade do MAb 4A2 de reconhecer três diferentes cepas de M. hyopneumoniae, no entanto, a cepa ATCC®25617TM foi significativamente (p<0.01) menos reconhecidas que as cepas ATCC®25095TM e ATCC 25088. Posteriormente, utilizamos o MAb 4A2 para desenhar um moderno ELISA baseado em antígenos corretamente orientados para detectar IgG de suínos contra M. hyopneumoniae. Nossos resultados preliminares monstraram que este ELISA tem maior sensibilidade em comparação com um ELISA comercial globalmente utilizado para a detecção sorológia de IgGs anti M. hyopneumoniae; consequentemente, nosso ELISA possui melhor capacidade de detectar animais com baixos niveis de IgG reativas ao microrganismo. Este novo ELISA consiste numa promissora plataforma de diagnóstico ultra-sensível para detectar anticorpos contra Mycoplasma hyopneumoniae.

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Development of a novel antigen-oriented ELISA for Mycoplasma hyopneumoniae diagnosis Author: Rafaela Luiza Klein Advisor: Rafael Frandoloso Swine enzootic pneumonia (EP) is an infectious disease globally disseminated in the pig industry. EP is caused by Mycoplasma hyopneumoniae, a pig-specific bacterium that can be transmitted through direct and indirect. The disease affects pigs of all ages, but the clinical manifestation is commonly observed in the pig growth and finishing phase. M. hyopnuemoniae can produce pulmonary disease independently, however, its infection facilitates the occurrence of other secondary infections that can causing pneumonia and systemic diseases. The diagnosis of M. hyopneumoniae circulation is performed through serological tests in combination with molecular techniques, and the its prevention is carrying out mainly by the use of classic vaccines applied by the intramuscular or intradermal route. Serological diagnosis has a pivotal role for the correct positioning of vaccines based on the understanding of the kinetics of natural antibodies acquired through colostrum, or even, developed after an infection process. So, develop a genuine immunological test capable of detecting M. hyopenumoniae is essential for Brazil. In this dissertation, we present the development, characterization and use of a new monoclonal antibody to design a novel ELISA based on oriented-antigen to detect antibodies reactive to Mycoplasma hyopneumoniae. Monoclonal antibody (MAb) against Mycoplasma hyopneumoniae was obtained by the fusion of P3x63Ag8.653 murine myeloma cells and spleen cells from BALB/c mice immunized with a suspension of M. hyopneumoniae strain ATCC®25095TM. One MAb showed strong reactivity in ELISA and was further characterized using Western blot, Dot Assay, Flow Cytometry and Avidity test. MAb 4A2 is an IgG1 paired with a lambda light chain molecule that recognize a common linear epitope displayed on the structure of two proteins with a molecular mass of 46 and 100 kDa expressed on the surface of M. hyopneumoniae. The avidity index of MAb 4A2 was 0.5 M of ammonium thiocyanate and cross-reactivity with Glaesserella parasuis by Dot Assay was not observed. Flow cytometry analysis showed the capacity of MAb to recognize three different strains of M. hyopneumoniae, however, the strain ATCC®25617TM was significantly less recognized than ATCC®25095TM and ATCC 25088. Further we used the MAb 4A2 to designing a novel antigen-oriented ELISA to detect pig IgG against M. hyopneumoniae. Our preliminary results showed that this ELISA has higher sensitivity than a current commercial ELISA Kit and consequently, better capacity to detect animals with low level of IgG against this microorganism. This novel ELISA is a promising and reliable serological diagnostic for M. hyopneumoniae.

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