título "Listeria monocytogenes IN A BRAZILIAN PORK PRODUCTION CHAIN AND ADHESION FEATURES OF ISOLATES

RESUMO

L. monocytogenes está presente em baixas frequências em animais a serem abatidos, mas pode persistir por longos períodos no ambiente de processamento de alimentos. No presente estudo, a contaminação por L. monocytogenes foi avaliada em diferentes etapas de uma cadeia produtiva de carne suína no Estado de Minas Gerais. Dez lotes de suínos foram amostrados em diferentes etapas da cadeia de produção, abrangendo amostras de galpão de terminação, abate (após sangria, após chamuscamento, após evisceração e após lavagem final), processamento (facas, mesas de desossa e mão de manipuladores) e produtos finais (costelas, paleta, pernil e linguiça) totalizando 670 amostras. Todas as amostras foram submetidas à detecção de L. monocytogenes, e os isolados obtidos foram caracterizados por análises bioquímicas, sorogrupos, genes de virulência, PFGE, susceptibilidade à antibióticos e habilidade de adesão. Os resultados revelaram a baixa ocorrência de Listeria spp. na cadeia de produção de suínos avaliada. No entanto, quatro amostras de linguiça testadas (40%) foram positivas para Listeria spp., Sendo L. monocytogenes identificada em duas (20%). Dez isolados foram identificados como L. monocytogenes (oito de serogrounp 1/2a ou 3a e dois de sorogrupo 4b, 4d ou 4e), todos positivos para genes relacionados a virulência hlyA, iap, plcA, actA, inlA, inlB, inlC e inlJ e suscetíveis aos antibióticos testados. Uma amostra de linguiça foi contaminada por ambos os sorogrupos 1/2a ou 3a e 4b, 4d ou 4e. Os isolados do sorogrupo 1/2a ou 3a obtidos nas visitas 5 e 6 apresentaram perfis genéticos distintos por PFGE, sugerindo que a contaminação pode vir de fonte diferente. O potencial de adesão exibido por Listeria spp. isolados (n = 18) variaram de fraco (sorogrupo 4b, 4d ou 4e) a moderado (L. innocua e L. monocytogenes sorogrupo 1/2a ou 3a). Apesar da baixa ocorrência de L. monocytogenes, foram detectados sorogrupos patogênicos em linguiça, exigindo medidas de controle por parte da indústria. Uma vez que L. monocytogenes é um patógeno capaz de aderir a variadas superfícies e formar biofilmes, o que pode explicar sua persistência em ambientes de processamento de alimentos este trabalho também avaliou a capacidade de adesão de L. monocytogenes e a interferência de fatores estressantes na capacidade de adesão de cepas selecionadas (cepas de L. monocytogenes pertencentes às linhagens I e II, também provenientes do ambiente de processamento de carnes, caraterizadas em trabalhos paralelos por forte potencial adesão (1 isolado) e capacidade de persistência no ambiente de processamento por 3 anos (2 isolados)), estes isolados foram incorporados a este trabalho e testados junto a 3 isolados provenientes de linguiça. Estes isolados foram submetidos a testes de potencial de adesão e concentração inibitória mínima contra quatro desinfetantes. A capacidade de adesão dos isolados selecionados também foi testada considerando diluições de desinfetantes, concentrações de NaCl e sais de cura, tempo de incubação e temperatura. Cada isolado foi classificado de acordo com sua capacidade de adesão como fraco, moderado ou forte. Os quatro desinfetantes testados foram eficazes na eliminação de L. monocytogenes. Os isolados selecionados para testes de estresse apresentaram maior capacidade de adesão a 37 °C/ 72 horas, e os meios com 5% de NaCl e amônia quaternária (11,024) foram ineficazes na inibição da adesão ao poliestireno. Os dados coletados permitiram a identificação do potencial de adesão de L. monocytogenes, da eficácia dos sanitizantes testados no controle da contaminação por este patógeno e a capacidade de adesão na presença de amônio quaternário (11024) e sais de alguns isolados. Considerando sua habilidade de adesão em condições estressantes nos testes descritos acima e o fato de terem o genoma sequênciado por (cg) MLST em estudos paralelos quatro isolados de L. monocytogenes pertencentes às linhagens I e II provenientes do ambiente de processamento de carne foram ainda investigados para capacidade de formação de biofilme em aço inoxidável na presença de sal de cura 7.5% (linhagem I) e amônio quaternário (11,024) (linhagem II). Adicionalmente foi realizada uma análise preditiva da expressão dos genes relacionados à formação de biofilme e adaptação a condições estressantes por ensaios qPCR (previamente detectados por análise in silico do genoma dos isolados selecionados, caracterizado por cg MLST em trabalhos paralelos). A formação de biofilme de L. monocytogenes em aço inoxidável foi testada em dois sistemas diferentes (microplaca e cupons) a 37 °C por 72 horas. Os ensaios foram realizados como triplicatas biológicas e incluíram os controles apropriados para verificar diferenças significativas pela análise de variância (p < 0,05). Foi possível observar que as linhagens testadas (I e II) foram capazes de formar biofilme em aço inoxidável. Embora os tratamentos utilizados em cada linhagem tenham sido significativos na redução do biofilme formado (p < 0,05), os isolados foram capazes de formar biofilme na condição de estresse avaliada. As suspensões de biofilme de L. monocytogenes a partir de testes em cupons de aço inoxidável deram resultados positivos em ensaios de qPCR para onze genes alvo testados. De maneira geral este trabalho demonstrou que o suíno não pareceu ser um portador representativo deste patógeno. Mesmo que não tenha sido possível a obtenção de amostras positivas para L.monocytogenes oriundas do ambiente de abate e processamento amostrado, a obtenção de produtos finais (linguiça) contaminados com sorogrupos patogênicos evidencia o risco de saúde ao consumidor final e a capacidade deste patógeno em persistir no ambiente de processamento de carne suína, uma vez que sua presença foi detectada no produto final. Os isolados de L. mococytogenes obtidos pertencem às linhagens filogêneticas reconhecidas por serem altamente adptadas ao ambiente de processamento de alimentos, e apresentaram habilidade em aderir às superfícies testadas sob condições de estresse. A reconhecida capacidade deste patógeno em formar biofilme em superfícies comumente encontradas no ambiente de processamento de carnes também pôde ser demonstrada, os isolados testados foram capazes de formar biofilme em aço inoxidável na presença de agentes usualmente utilizados para preparações de embutidos e também nos procedimentos de limpeza e desinfecção da planta de processamento. A analise in silico do cg MLST destes isolados permitiu a identificação de regiões genômicas relacionadas à formação de biofilme e adaptação a condições ambientais estrassantes, em isolados das linhagens I e II, sendo ainda possível detectar a ação desta maquinaria genética na formação de biofilme em aço inoxidável sob ação de agentes estressantes, pela predição da expressão de onze gene alvo realizada por qPCR.

ABSTRACT

L. monocytogenes is present at low frequencies in animals to be slaughtered but may persist for long periods in the food processing environment. In the present study, L. monocytogenes contamination was evaluated at different stages of a pork meat production chain in the state of Minas Gerais. Ten lots of pigs were sampled at different stages of the production chain, covering samples from termination sheds, slaughtering (after bleeding, after singeing, after evisceration and after final washing), processing (knives, deboning tables and hand handlers) and end products (ribs, shoulder, ham and sausage) totaling 670 samples. All samples were submitted to L. monocytogenes detection, and the isolates obtained were characterized by biochemical analyzes, serogroups, virulence genes, PFGE, antibiotic susceptibility and adhesion ability. The results revealed the low occurrence of Listeria spp. in the pork production chain evaluated. However, four sausage samples tested (40%) were positive for Listeria spp., with L. monocytogenes identified in two (20%). Ten isolates were identified as L. monocytogenes (eight from serogrounp 1/2a or 3a and two from serogrounp 4b, 4d or 4e), all positive for virulence-related genes hlyA, iap, plcA, actA, inlA, inlB, inlC and inlJ and susceptible to the tested antibiotics. A sausage sample was contaminated by both serogroups 1/2a or 3a and 4b, 4d or 4e. Isolates from serogroup 1/2a or 3a obtained at visits 5 and 6 showed distinct genetic profiles by PFGE, suggesting that contamination may come from a different source. The adhesion potential exhibited by Listeria spp. isolates (n = 18) ranged from weak (serogroup 4b, 4d or 4e) to moderate (L. innocua and L. monocytogenes serogroup 1/2a or 3a). Despite the low occurrence of L. monocytogenes, pathogenic serogroups were detected in sausage, requiring industry control measures. Since L. monocytogenes is a pathogen capable of adhering to various surfaces and forming biofilms, which may explain its persistence in food processing environments, this work also evaluated L. monocytogenes adhesion capacity and the interference of stress factors on adhesion capacity of selected strains (L. monocytogenes strains belonging to lineages I and II, also coming from the meat processing environment, characterized in parallel work by strong adhesion potential (one isolate) and persistence capacity in the processing environment for 3 years (two isolates)), were incorporated into this work and tested with 3 selected isolates from sausage samples. These isolates were submitted to adhesion potential and minimum inhibitory concentration tests against four disinfectants. The adhesion capacity of the selected isolates was also tested considering disinfectant dilutions, NaCl concentrations and curing salts, incubation time and temperature. Each isolate was classified according to its adherence capacity as weak, moderate or strong. The four disinfectants tested were effective in eliminating L. monocytogenes. The isolates selected for stress tests showed greater adhesion capacity at 37 °C/72 hours, and the BHI broth with 5% NaCl and quaternary ammonia (1 1,024) were ineffective in inhibiting polystyrene adhesion. The collected data allowed the identification of the adhesion potential of L. monocytogenes, the efficacy of the sanitizers tested in the control of contamination by this pathogen and the adhesion capacity in the presence of quaternary ammonium (1 1,024) and salts of some isolates. Considering their ability to adhere to stressful conditions in the tests described above and the fact that they have the genome sequenced by (cg) MLST in parallel studies four isolates of L. monocytogenes belonging to strains I and II from the meat processing environment were further investigated for stainless steel biofilm formation capacity in the presence of curing salt 7.5% (lineage I) and quaternary ammonium (1 1,024) (lineage II). Additionally, a predictive analysis of gene expression related to biofilm formation and adaptation to stressful conditions was performed by qPCR assays (previously detected by in silico genome analysis of selected isolates, characterized by (cg) MLST in parallel work). L. monocytogenes biofilm formation in stainless steel was tested in two different systems (microplate and coupons) at 37 °C for 72 hours. Assays were performed as biological triplicates and included appropriate controls to verify significant differences by analysis of variance (p < 0.05). It was observed that the tested strains (I and II) were able to form stainless steel biofilm. Although the treatments used in each strain were significant in reducing the biofilm formation (p < 0.05), the isolates were able to form biofilm under the stress condition evaluated. L. monocytogenes biofilm suspensions from stainless steel coupon testing gave positive results in qPCR assays for eleven target genes tested. In general this work showed that the pig did not appear to be a representative carrier of this pathogen. Even though it was not possible to obtain positive samples for L. monocytogenes from the slaughtered and processing environment, obtaining final products (sausage) contaminated with pathogenic serogroups shows the health risk to the final consumer and the ability of this pathogen to persist in the pork meat processing environment once its presence has been detected in the final product. The isolates of L. mococytogenes obtained belong to phylogenetic lineages recognized for being highly adapted to the food processing environment, and showed ability to adhere to the tested surfaces under stress conditions. The recognized ability of this pathogen to form biofilm on surfaces commonly found in the meat processing environment could also be demonstrated, the tested isolates were able to form stainless steel biofilm in the presence of agents usually used for sausage preparations and also in the processing plant cleaning / disinfection procedures. The in silico analysis of cg MLST allowed the identification of genomic regions related to biofilm formation and adaptation to stressful environmental conditions in lineages I and II isolates. It is also possible to detect the action of this genetic machinery in the stainless steel biofilm formation under action of stress factors, by predicting the expression of eleven target genes performed by qPCR.