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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213105

Resumo

A análise da expressão gênica é cada vez mais importante na pesquisa biológica. A PCR em tempo real de transcrição reversa (RT-PCR) tem se tornando o método de escolha para o perfil de expressão de alta produtividade e precisão de genes selecionados, dado o aumento da sensibilidade, reprodutibilidade e grande alcance dinâmico desta metodologia, os requisitos para um gene de controle interno adequado para normalização tornaram-se cada vez mais rigoros. No primeiro experimento, o objetivo foi identificar os genes de referência (GRs), expressos de forma mais estável em tipos celulares específicos investigados em ovinos, além de determinar o número mínimo de GRs necessários para normalização da expressão gênica. Dos onze RGs candidatos (ACT, ATP1A1, GAPDH, H3F3A, HPRT1, PPIA, RPL19, SDHA, TBP, UBB e YWHAZ) testados para normalização RT-qPCR durante o estádio de pré-implantação (ovócitos, embriões em estádio de clivagem e mórulas compactas). Sete primers foram eficientes (97,20 % - 105,96 %). O software GeNorm indicou GAPDH e TBP como o melhor par de RG, e H3F3A e YWHAZ foram o terceiro e quarto RGs mais estáveis, respectivamente. O software NormFinder descreveu o H3F3A como o RG mais estável, enquanto o YWHAZ e o H3F3A foram o par de RG mais apropriado. O fator de transcrição (FT) ZFX foi regulado negativamente em embriões em estádios de clivagem ao comparar estes dois estádios de desenvolvimento usando dois GRs (GAPDH e TBP). A abundância de transcritos do gene associada à pluripotência de desenvolvimento 3 (DPPA3) foi similar entre todos os estádios independentemente do uso de dois ou três GRs. No segundo experimento, o objetivo foi compreender a expressão temporal e padrões dinâmicos dos FT associados à pluripotência (FTAP) durante o desenvolvimento totipotente de embriões ovinos, sendo particularmente relevante por se tratar de um espécie pouco explorada. Foi possível observar eficiência de todos os oito primers de FTAP candidatos (91,98% - 104,46%). Quatro padrões de expressão dos FTAP foram encontrados em embriões totipotentes de ovinos. Primeiramente, os transcritos dos genes RXRB e TCF3 foram detectados apenas em oócitos. Em segundo lugar, a abundância de transcritos de genes não variou entre os estádios de desenvolvimento (isto é, RONIN e SP1). Em terceiro lugar, a abundância de transcritos de genes foi maior no estágio de clivagem, como encontrado para NR5A2 e SF1. Finalmente, a abundância de transcritos gênicos foi maior no estádio mórula (SF1, UTF1 e ZFP281). Assim, as FTAP mantêm padrões dinâmicos de expressão durante o desenvolvimento totipotente de ovelhas e contribuem para a elucidação da embriogênese nesta espécie.

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Gene expression analysis is increasingly important in biological research, with real-time reverse transcription (RT-PCR) PCR becoming the method of choice for the high productivity and precision expression profile of selected genes, given the increased sensitivity, reproducibility and wide dynamic range of this methodology, the requirements for an internal control gene suitable for normalization have become increasingly rigorous. In the first experiment, the objective was to identify the reference genes (RGs), expressed more stable in specific cell types investigated in sheep, in addition to determining the minimum number of RGs required for normalization of gene expression. Of the eleven candidate RGs (ACT, ATP1A1, GAPDH, H3T3A, HPRT1, PPIA, RPL19, SDHA, TBP, UBB and YWHAZ) tested for RT-qPCR normalization during the preimplantation stage (oocytes, cleavage stage embryos and morulae compact). Seven primers were efficient (97.20% - 105.96%). GeNorm software found GAPDH and TBP as the best pair of RGs, and H3F3A and YWHAZ were the third and fourth most stable RGs, respectively. NormFinder software described H3F3A as the most stable RG, while YWHAZ and H3F3A were the most appropriate RG pair. The transcription factor (FT) ZFX was downregulated in embryos at cleavage stages when comparing these two developmental stages using two GRs (GAPDH and TBP). The abundance of gene transcripts associated with developmental pluripotency 3 (DPPA3) was similar across all stages regardless of the use of two or three GRs. In the second experiment, the objective was to understand the temporal expression and dynamic patterns of FTAP associated to pluripotency during the totipotent development of ovine embryos, being particularly relevant because it is an unexplored species. It was possible to observe efficiency of all eight candidate FTAP primers (91.98% - 104.46%). Four patterns of FTAP expression were found in totipotent ovum embryos. First, transcripts of the RXRB and TCF3 genes were detected only in oocytes. Second, the abundance of gene transcripts did not vary between the developmental stages (i.e., RONIN and SP1). Third, the abundance of gene transcripts was higher at the cleavage stage, as found for NR5A2 and SF1. Finally, the abundance of gene transcripts was higher at the morula stage (SF1, UTF1 and ZFP281). Thus, FTAP maintain dynamic patterns of expression during the totipotent development of sheep and contribute to the elucidation of embryogenesis in this species.

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