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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213113

Resumo

A inseminação artificial tem grande relevância na suinocultura uma vez que propicia vários benefícios relacionados ao incremento genético. No entanto, o fato das doses inseminantes serem conservadas a 15-18°C traz uma série de inconvenientes, como sua logística de distribuição. Sendo assim, o interesse no desenvolvimento de protocolos de criopreservação do sêmen suíno tem atraido maior atenção. O espermatozoide suíno, devido a sua constituição da membrana plasmática é muito sensível às variações de temperatura abaixo de 15°C, bem como ao congelamento. Apesar de não ser claro, o mecanismo da maior sensibilidade celular às baixas temperaturas pode estar associado a características de membrana plasmática sendo possível que o metabolismo do Ca2+, possa estar envolvido. A hipótese deste estudo assume que a criopreservação afeta o funcionamento correto dos canais de Ca2+, prejudicando dessa forma, os índices de fertilidade na espécie suína. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do resfriamento a 15°C, 5°C e da criopreservação sobre o influxo de Ca2+ em populações de espermatozoides suínos. O sêmen foi coletado de cinco reprodutores, processado em heterospermia. Os grupos experimentais foram compostos por: R0) sêmen resfriado a 15-18°C, avaliado no dia da coleta; R5) sêmen resfriado a 5°C, avaliado 24 h após a coleta; R15) sêmen resfriado a 15-18°C, avaliado 24 h após a coleta e Crio) sêmen criopreservado. A avaliação funcional dos espermatozoides em cada tratamento foi realizada por citometria de fluxo, utilizando os seguintes ensaios: a) viabilidade celular (iodeto de propídio (PI)); b) potencial de membrana mitocondrial (Rodamina123); c) concentração intracelular de Ca2+ (Fluo- 4AM) e; d) atividade de canais CatSper, utilizando um antagonista de canais de Ca2+ tipo T (NNC-55-0396). Os espermatozoides de todos os grupos foram incubados a 37°C em meio capacitante por uma hora antes da preparação das amostras para citometria. Os experimentos foram repetidos cinco vezes, analisando 10.000 espermatozoides (eventos) por ensaio. Análise de motilidade e vigor espermático de todas as amostras foi realizada anteriormente a avaliação citométrica. As diferenças foram consideradas significativas a 5%. A motilidade do sêmen descongelado (Crio) foi de 55%, diferindo dos grupos R0 (86,7%), R15 (83,3%) e R5 (81,7%). O vigor espermático dos grupos R0 (3,8), R15 (3,7) e R5 (3,5) foi superior ao do grupo Crio (3,0). Células positivas para PI nos grupos R0 (8,2), R15 (9,4%) e R5 (5,3) tiveram mesmo desempenho estatístico, entretanto foram diferentes do grupo Crio, com 29,9% de células PI-positivas. A atividade mitocondrial nos grupos R0 (98,4%) e R15 (93,9%) diferiu do grupo R5 (71,5%), mas não foi diferente do grupo Crio (85,3%). Entretanto, o grupo Crio teve atividade mitocondrial igual ao grupo R5. O influxo de Ca2+ no grupo R5 (58,8%) foi menor quando comparado aos demais grupos (98% para R0, 96,2% para R15 e 83,6% para Crio). O uso de um inibidor de CatSper não teve efeito no influxo de Ca2+ nos grupos R0 (91,3%), R5 (53,1%) e R15 (89,7%), entretanto reduziu a entrada deste íon quando o sêmen que foi criopreservado e descongelado (60,0%). Os dados encontrados sugerem que, apesar de não ser claro como o congelamento altera o efeito do composto NNC sobre as células criopreservadas, o resfriamento a 5°C e criopreservação alteram o influxo de Ca2+ em espermatozoides suínos.

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Artificial insemination is relevant in swine as a tool for genetic improvement. However, the fact that the inseminating doses are conserved at 15-18°C brings limitations such as the transport of the genetic material to long distances and long-term storage. Therefore, the development of protocols for cryopreservation of swine semen has drawn substantial attention. Porcine sperm is very vulnerable to temperature fluctuation, especially those below 15°C, including cryopreservation. Although the mechanism by which low temperatures cause cell damage is not clear, it may be associated with plasma membrane characteristics and it is possible that Ca2+ metabolism may be involved. It is possible that cryopreservation and storage at low temperatures affect the appropriate operation of Ca2+ channels, thus impairing swine fertility. The goal of this work was to evaluate the effects of cooling porcine sperm at 15°C, 5°C and cryopreservation on the influx of Ca2+. The semen was collected from five mature males, pooling the ejaculate of two or three boars (heterospermia) at a time. The experimental groups were composed of: R0) semen cooled to 15-18°C, evaluated on the day of collection; R5) semen cooled to 5°C, evaluated 24 h after collection; R15) semen cooled to 15-18°C, evaluated 24 h after collection and cryo) cryopreserved semen. The functional evaluation of spermatozoa in each treatment was performed by flow cytometry, using the following assays: a) cell viability (propidium iodide (PI)); b) mitochondrial membrane potential (Rodamine123); c) intracellular concentration of Ca2+ (Fluo-4AM) and; d) CatSper channel activity using a T-type Ca2+ channel antagonist (NNC-55-0396). Spermatozoa of all groups were incubated at 37°C in capacitating medium for one hour prior to preparation of the samples for cytometry. The experiments were repeated five times, analyzing 10,000 sperm (events) per assay. Analyses of motility and sperm vigor of all samples was performed prior to the cytometric evaluation. Differences were considered significant if p < 0.05. The motility of thawed semen (Cryo) was 55%, differing from the R0 (86.7%), R15 (83.3%) and R5 (81.7%) groups. Sperm vigor of groups R0 (3.8), R15 (3.7), and R5 (3.5) was higher than that of the Cryo group (3.0). PI-positive cells in R0 (8.2), R15 (9.4%), and R5 (5.3) groups had same statistical performance, but were different from the Crio group, with 29.9% dead cells. Mitochondrial activity in R0 (98.4%) and R15 (93.9%) groups differed from the R5 group (71.5%), which was not different from Crio group (85.3%). However, Cryo and R5 groups had same mitochondrial activity. The proportion of cells displaying high intracellular Ca2+ in the R5 group (58.8%) was decreased when compared to the other groups (98% for R0, 96.2% for R15 and 83.6% for Crio). The use of a CatSper inhibitor had no effect on the Ca2+ influx in the R0 (91.3%), R5 (53.1%) and R15 (89.7%) groups, however, it reduced the entry of this ion when the semen was cryopreserved and thawed (60.0%). While the mechanism by which freezing alters the effect of the NNC compound on cryopreserved cells is not completely clear, these data suggest that cooling at 5°C and cryopreservation alter the influx of Ca2+ in swine spermatozoa.

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